大孔樹脂法對益陰消渴滴丸的純化工藝研究

陳 利 ，宋國紅 ，李 卿

（1.重慶醫科大學附屬第二醫院江南分院藥學部，重慶 400010； 2.重慶市中藥研究院，重慶 400065）

益陰消渴原劑型為膠囊劑，功能主治為益氣養陰、清熱生津，用于氣陰不足所致消渴，以及2型糖尿病見上述證候者[1]，作用明確，成分清楚。處方中君藥葛根所含葛根素不僅具有較好的降血糖作用，同時還具有改善糖尿病并發癥的藥理活性。研究表明，葛根素能改善胰島素抵抗，降低糖尿病大鼠血糖和保護其腎臟功能。處方中其余3味中藥也具有較好的降血糖作用。由于原制劑生產工藝簡單，采用部分藥物粉碎后直接入藥的方式，其余藥材水煎煮入藥，導致葛根素溶出受限，影響臨床療效。本研究中采用單因素試驗、正交試驗法優選了益陰消渴處方提取工藝，選用大孔樹脂柱層析法對處方中的有效部位群進行了富集純化，以處方君藥葛根中主要成分葛根素為測評指標，優化益陰消渴方的分離純化工藝，為后續的制劑成型提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SB－5200D型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH－S型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；AE240型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

葛根、野苦瓜、荔枝核、山藥藥材均購自重慶市菜園壩中藥材市場，經重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員分別鑒定為豆科植物甘葛藤 Pueraria thomsonii Benth.的干燥根、葫蘆科植物野苦瓜 Momordica charantia L.的成熟果、無患子科植物荔枝 Litchi chinensis Sonn.的干燥成熟種子、薯蕷科植物薯蕷 Dioscorea opposite Thunb.的干燥根莖；D101型大孔樹脂（天津市海光化工有限公司）；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號為752－200108）；甲醇為色譜純，水為一級水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 葛根素含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －水（28∶72）；流速：1 mL ／min；柱溫：30℃；紫外檢測波長：250 nm。選擇葛根素含量為檢測指標，按2015年版《中國藥典（一部）》[1]葛根藥材含量測定方法進行測定。結果可見，葛根素峰與相鄰峰分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

取葛根素對照品18.64 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。

照益陰消渴處方比例，稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第 1次回流 1.5 h，第 2次、3次回流 1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇，加水適量使溶解，靜置，取上清液過D101型大孔樹脂，棄去過柱液，用水洗至近無色，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，于水浴上分別濃縮至干，減壓干燥，稱定固形物質量，作為供試品，并制備供試品溶液。

照益陰消渴處方比例，稱取缺葛根的其余3味藥材，照供試品的提取方法，制得缺葛根陰性樣品，并制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取對照品貯備溶液0.5，1，2，4，5 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10 μL，進樣，按擬訂色譜條件進樣測定，以葛根素進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝7 131 295 X－34 632，r＝0.999 9（n＝6）。結果表明，葛根素進樣量在0.372 8～3.728 0 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品貯備溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續進樣6次。結果的 RSD為0.78%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，1，4，8，16 h時進樣測定。結果的 RSD 為 0.94% （n＝6），表明供試品溶液在16 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定葛根素峰面積，計算其含量。結果的 RSD為1.06%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一樣品6份，精密加入葛根素對照品適量，照2.2項下方法，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定葛根素峰面積，計算其含量及回收率。結果見表1。

2.2 富集純化工藝考察

2.2.1 大孔樹脂乙醇洗脫用量考察

按處方比例，稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用6倍量70%乙醇回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇至無醇味，加10倍量水使溶解，靜置，取上清液過D101型大孔樹脂，棄去過柱液，用水洗至近無色，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，每次20 mL，收集8次，于水浴上分別濃縮至干，減壓干燥，稱定固形物質量，測定葛根素含量。結果見圖2。可見，以70% 乙醇洗脫時，葛根素集中于2～3倍洗脫量，其固形物質量、葛根素含量85%以上均集中在此部分。故在吸附樣品后，加水洗脫至近無色，再用70%乙醇（用藥材量的8倍量）洗脫時，即可。

表1 葛根素加樣回收試驗結果（n＝6）

圖2 乙醇洗脫解吸曲線

2.2.2 大孔樹脂用量考察

按處方比例，稱取野苦瓜25 g，葛根155 g，荔枝核10 g，山藥10 g，用6倍量70%乙醇回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇至無醇味，加10倍量水使溶解，靜置，取上清液并溶解至2 000 mL，備用。

分別取5根玻璃柱（直徑為1 cm），稱取大孔樹脂17.5 g（相當于干樹脂 5 g），分別取上述溶液 20 mL（相當于 2 g 藥材）、30 mL（相當于 3 g 藥材）、50 mL（相當于5 g 藥材）、100 mL（相當于 10 g 藥材）、200 mL（相當于20 g藥材），過D101型大孔樹脂，分別用藥材量的25倍量水洗滌，收集過柱液和水洗液，再用藥材8倍量的70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，分別于水浴上濃縮至干，減壓干燥，稱定固形物質量，計算葛根素含量，公式如下。結果見表2。可見，綜合分析后選用3 g藥材、5 g樹脂，即藥材量 － 樹脂量（0.6 ∶1）。

2.2.3 大孔樹脂徑高比考察

按處方比例稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用已確定的條件提取，提取液均分為3等份，備用；取徑高比為 1 ∶3.4，1 ∶5，1 ∶7 的樹脂柱，各加入已處理好的 D101型大孔樹脂 8 g（濕法裝柱）。將藥材提取液分別上柱，待上柱液流完后，用8倍量70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，分別于水浴上濃縮至干，減壓干燥，稱定固形物質量，測定葛根素含量。結果徑高比為1 ∶3.4，1 ∶5，1 ∶7 時 葛 根素含 量分別 為 0.28% ，0.26%，0.25%。經 D101大孔樹脂處理，樹脂徑高比為1∶3.4效果更優。

表2 不同量益陰消渴提取液對吸附純度效果的影響

2.2.4 藥液上樣質量濃度考察

按處方比例稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用已確定的條件提取，回收乙醇，加10倍量水使溶解，取上清液均分為3等份，備用；溶液1為每1 mL相當于0.04 g藥材的溶液，溶液2濃縮至每1 mL相當于0.4 g藥材的溶液，溶液3濃縮至每1 mL相當于0.8 g藥材的溶液，備用。取徑高比為1∶3.4的樹脂柱，加已處理好的D101型大孔樹脂9 g（濕法裝柱）。將藥材提取液分別上柱，上柱液流完后，用8倍量70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于水浴上蒸干，減壓干燥，稱定固形物質量，測定葛根素含量。結果上樣濃度為 1 ∶0.04，1 ∶0.4，1 ∶0.8 時葛根素含量分別為 0.28% ，0.24% ，0.22% 。以藥材提取液上樣（0.04 g／mL）過 D101大孔樹脂處理，葛根素保留吸附率較好。故確定用藥材10倍量水溶解后，取上清液過柱。

2.2.5 藥液 pH 考察

按處方比例稱取稱取野苦瓜、葛根、荔枝核、山藥適量，用已確定的條件提取、回收乙醇，加水溶解，取上清液均分為4等份，備用。溶液1為原液；溶液2和溶液3用5%碳酸氫鈉溶液分別調pH為8和9；溶液4用5%鹽酸溶液調pH為6，備用。取徑高比為1∶3.4的樹脂柱，加已處理好的D101型大孔樹脂（濕法裝柱），將各供試溶液分別上柱，待上柱液流完后，用8倍量70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，水浴蒸干，減壓干燥，稱定固形物質量，測定葛根素含量。結果溶液4，2，3的葛根素含量分別為 0.25% ，0.25% ，0.24% ；溶液 1 含量為0.28%。表明測得樣品中葛根素的含量，用5%碳酸氫鈉溶液調pH 8和pH 9及用5%鹽酸溶液調pH 6的溶液均低于原液（即不調節pH），故藥材提取回收乙醇后，加水溶解不需調pH即可過大孔樹脂柱。

2.2.6 吸附流速和洗脫流速考察

關于吸附流速和洗脫流速，由于樹脂粒徑小，即使全部放開其速度也是很慢，屠鵬飛等[2]的研究也證明了這一點，并指出吸附流速和洗脫流速對目標成分的收率和含量基本無影響，故建議吸附流速采用全流速的1／2，洗脫流速采用全流速。

2.3 驗證試驗

根據擬訂的提取方法，稱取野苦瓜20 g、葛根124 g、荔枝核8 g、山藥8 g，共3份，采用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第1次回流1.5 h，第2，3次回流1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇，加10倍量水使溶解，照前述確定的各項參數進行大孔樹脂吸附－洗脫試驗，上柱前溶液和乙醇洗脫液分別用高效液相色譜法測定葛根素含量。結果見表3。可見，葛根素的收率與前面的吸附試驗和樹脂載量試驗的葛根素收率基本吻合，葛根素轉移率達85.14%，證明工藝可行。

表3 純化效果驗證試驗結果（%）

3 討論

3.1 檢測指標選擇

本試驗中以葛根素含量為檢測指標，考察了乙醇洗脫用量、大孔樹脂用量、樹脂徑高比、藥液上樣濃度、藥液pH對益陰消渴方有效部位群富集純化的影響，試驗結果表明，采用大孔樹脂分離純化后的處方固形物質量大為減少，以葛根素為代表的有效部位群純度增長顯著，通過減少固形物質量，而處方有效部位群相對穩定，為后續制備新型速釋制劑打下了良好的基礎。

3.2 大孔樹脂吸附分離技術優勢比較

與傳統的分離純化方法相比[3]，采用大孔樹脂吸附分離技術對中藥復方進行精制，從中提取有效部位（群）或有效成分（群），有明顯優勢。據報道，用樹脂對苷類[4]、黃酮[5]、萜類[6]、生物堿[7]、內酯[8]、有機酸[9]等的分離純化效果較好。本研究中篩選了不同型號的大孔樹脂用于本處方的分離純化試驗。結果表明，D101型大孔樹脂適用范圍較廣，對于非極性或弱極性的有機化合物普遍吸附能力強，特別是對皂苷類的分離、純化效果尤佳，對黃酮類化合物也適宜[10－13]。處方中野苦瓜主要化學成分包括三萜、甾類、生物堿等；葛根化學成分包括黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類、葛酚苷類等，其中異黃酮類為其主要有效成分，異黃酮類化合物有葛根素、大豆素、大豆苷等，葛根素為其主要成分；荔枝核含皂苷。D101型大孔樹脂經20多年的生產實踐證實，該產品植物水溶性物質分離、純化行之有效，工藝簡單，易于操作，產品質量穩定，成本較低，安全可靠，故選用D101型大孔樹脂對該方劑進行制備工藝的研究。

3.3 展望

益陰消渴原制劑為部分葛根藥材粉碎入藥，因而葛根中主要成分葛根素溶出較慢[14－15]，在人體內吸收和利用較差。前期研究報道了采用單因素影響試驗、正交試驗法優化處方提取工藝各項參數，在后續試驗過程中，選用大孔樹脂法對益陰消渴處方的有效部位群進行了富集、純化，實現了中間提取物收率減少和日服用量降低的目標，可加快藥物中有效成分溶出的速度，提高生物利用度，為該產品的工業化生產提供了參考。