凝血因子的多點稀釋分析(MDA)方法在篩查病理性抗凝物中的應用

程 航,冀續峰,劉海艷,李 瑞,安倍瑩*

(1.吉林大學第一醫院 小兒呼吸一科,吉林 長春130021；2.吉林大學白求恩第一醫院 檢驗科,吉林 長春130021；3.吉林省白城市鎮賚縣人民醫院 檢驗科,吉林 白城)

病理性循環抗凝物質臨床常見于獲得性的凝血因子抑制物和狼瘡性抗凝物質。獲得性的凝血因子抑制物可直接作用于一種特異性凝血因子引起出血,臨床研究發現有相當多的A型血友病患者,在經過若干次輸血后,機體會產生抗凝血因子Ⅷ的抗體,從而結合Ⅷ因子,降低了治療效果[1,2]。狼瘡抗凝物(Lupus anticoagulants,LAC)是一種磷脂依賴的病理性循環抗凝物質,為IgG或IgM的異質性免疫球蛋白。主要通過結合β2糖蛋白I(β2-glyeoprotein I,β2-GP I)、人凝血酶原(prothrombin,PT)及其他磷脂復合物來干擾磷脂依賴的凝血過程,使凝血時間延長[3]。持續的LAC陽性患者被認為有較高的血栓形成和復發風險,與不明原因習慣性流產、死胎、易栓性疾病及某些自身免疫性病的危險信號[4,5]。這兩類病理性抑制物都會引起APTT延長,干擾凝血因子的定量檢測,因此在凝血因子定量檢測時凝血因子含量低的患者中,需要排除是否存在病理性抑制物的干擾引起的假性減低。

多點稀釋(Multi dilution analysis,MDA)分析是指樣本按照不同的稀釋度進行稀釋(1/1、 1/2、 1/4、 1/8等),在不同的稀釋倍數下,由于凝血因子的促凝過程是一系列酶促反應的過程,反應的速度和強度在一定范圍內與凝血因子的活性(濃度)線性相關,故稀釋后各濃度血漿的凝血因子促凝活性通過乘以稀釋倍數,可回歸為相同(相近)的結果。如果單純的凝血因子缺乏,經過多點稀釋分析,稀釋比例和因子濃度呈線性,該凝固曲線和標準曲線應該是平行的,若存在病理性的抗凝物質如FⅧ抗體,稀釋后隨著凝血因子FⅧ和凝血因子FⅧ抗體濃度同時下降,失去抗原抗體反應的最適比例,稀釋后的曲線和標準曲線呈交叉[6,7]。

本研究采用多點稀釋的方法測定FⅧ:C,根據樣本曲線和標準曲線的關系來來篩查樣本中是因子含量缺乏、或者存在抗因子抗體或是存在狼瘡抗凝物質導致的因子含量缺乏,評價MDA作為篩選病理性抗凝物的試驗作初步研究。

1 對象和方法

1.1 研究對象

2017年10月至2018年10月期間住院診斷血友病A患者102例,中位年齡26歲(1歲-70歲),血友病A嚴重程度依據世界血友病聯盟推薦的標準進行分型[8]。14例抗磷脂綜合征的患者。正常對照組20例,男女各半,均來自我院健康體檢者,無心、肝、腎病史,無服藥史,年齡在20-66歲。

1.2 方法

1.2.1標本采集與制備

所有受檢者均空腹采集109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝血2.7 ml,抗凝劑與樣本體積比例為1∶9。樣本采集后2 h在室溫下1 500×g,二次離心10 min,以保證如乏血小板血漿中血小板計數<10×109/L。血漿-80℃凍存,檢測前37℃水浴快速復融。標本無黃疸、無乳糜、無溶血。

1.2.2儀器及試劑

采用Sysmex 公司的CS-5100全自動凝血分析儀器及配套試劑,基于測定APTT的一期凝固法檢測FⅧ:C,選擇多點(1/1、 1/2、 1/4、 1/8、1/16等)稀釋方法(MDA)進行。

1.2.3抑制物確證實驗

采用改良的Bestheda法檢測FⅧ抑制物濃度滴度[9],制備標準曲線,用Dade Behringer緩沖液倍比稀釋患者乏血小板血漿,在對照管中加入等體積緩沖液,將以上各管均加入等體積正常人血漿,采用 Sysmex CS-5100全自動凝血分析儀及配套試劑,從FⅧ標準曲線測得各管中FⅧ活性,將倍比稀釋患者乏血小板血漿測得的FⅧ活性與對照管FⅧ活性比較,計算各管殘留FⅧ%,查表 1得Bethesda單位,將查得的Bethesda單位乘稀釋倍數即得抑制物量。

1.2.4狼瘡抗凝物質(LAC)檢測

采用改良的稀釋蝰蛇毒時間(Dilute Russell′s viper venom time,dRVVT) 檢測LA(為美國Beckman 公司試劑),采用采用IL-TOP 700 全自動凝血分析儀檢測狼瘡抗凝物質,按試劑盒廠家提供的方法計算標準化的LA 比值,LA 比值>1.2 為陽性。

1.2.5APTT糾正實驗

APTT血漿糾正試驗,包括即刻和孵育后的APTT糾正實驗。等體積的正常混合血漿和患者血漿混合,即刻混合及混合后37℃孵育2h后分別測定APTT。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17．0軟件進行結果統計學分析。以經典的改良的Bestheda方法測定FⅧ抗體和dRVVT確診實驗為“金標準”,應用四格表評價MDA法作為篩查抗因子抗體和狼瘡抗凝物的篩查實驗的敏感度、特異度和準確度等。

2 結果

2.1 MDA檢測不同凝血FⅧ含量的曲線形式

20份正常體檢者混合血漿,配置不同濃度的FⅧ血漿,通過MDA檢測凝血因子Ⅷ的活性,驗證樣本曲線和標準曲線的關系,如圖1,當FⅧ：C ≥10%,樣本曲線和標準曲線大致平行；在FⅧ：C <10%,樣本曲線和標準曲線開始交叉；當FⅧ嚴重缺乏,如FⅧ<1%,雖然二者曲線也有交叉,但是因子濃度基本不隨著稀釋梯度改變而改變。與國外文獻結果報道相似[6]。

圖1 MDA測定不同濃度的FⅧ樣本曲線和標準曲線的關系

102例血友病A患者中,60例樣本曲線和標準曲線大致平行,FⅧ：C均在10%以上,血漿即刻和2 h孵育糾正實驗均是陰性,不存在病理性抗凝物質,說明在凝血因子FⅧ:C>10%時,可以通過MDA樣本曲線和標準曲線是否交叉來判斷標本凝血因子含量缺乏或者存在病理性抗凝物質；16例患者曲線也為交叉,糾正實驗判斷無病理性抗凝物質,測FⅧ：C較低,在1%-5% 之間,屬于中重度血友病患者。

2.2 MDA篩查抗因子抗體的結果

見表1,MDA篩查抗FⅧ因子抗體的敏感度80%,特異性68.3%,陽性預示率38%,陰性預示率93%,準確率71%；MDA顯示隨著稀釋度的增加,由于存在抗FⅧ抗體,因子含量和凝固時間不成比例,導致標準曲線和樣本曲線交叉,經過Bestheda測定抗FⅧ抗體滴度在3B.U.以上(圖2),MDA聯合血漿糾正實驗篩查FⅧ抗體,診斷效能明顯增強,敏感度80%,特異性87%,陽性預示率61.5%,陰性預示率94.7%,準確率86%,見表2。

表格1 MDA篩查抗FⅧ抗體和Bestheda方法測定結果比較

圖2 含有FⅧ抗體的MDA圖形

表2 MDA聯合血漿糾正實驗篩查抗FⅧ抗體和Bestheda方法測定結果比較

2.3 MDA篩查狼瘡抗凝物的結果

見表3,MDA篩查狼瘡抗凝物的敏感度71%,特異性63.6%,陽性預示率23%,陰性預示率93%,準確率64.7%； MDA顯示隨著稀釋度的增加,由于狼瘡抗凝物的存在,因子含量和凝固時間不成比例,隨著稀釋度增加,削弱了干擾因子凝血的能力,導致因子的含量反而增加,如圖3。

表3 MDA篩查抗狼瘡抗凝物和dRVVT 方法測定狼瘡抗凝物結果比較

MDA聯合血漿糾正實驗篩查LAC抗體,結果為敏感度71%,特異性82%,陽性預示率38%,陰性預示率94.7%,準確率80%,見表4。

3 討論

病理性抗凝物質是一種循環抗凝物質,通常屬于免疫球蛋白IgG抗體,實驗室診斷病理性抗凝物質的確證試驗操作較為復雜,如測定抗FⅧ抗體的Bethesda或Nijmegen方法或者ELISA方法；或者方法學的限制,如檢測狼瘡抗凝目前尚無參考物質和參考方法,分析前、分析中諸多因素(如樣本的準備、篩查試驗的檢測試劑和方法選擇)均可影響檢測結果的準確性和重復性,其臨床應用效果不好,這些確證實驗均不合適作為病理性抗凝物質的篩查方法[10]。

圖3 含有狼瘡抗凝物質的MDA結果

MDA+糾正實驗dRVVT陽性陰性合計陽性(交叉)101626陰性(平行)47276合計1488102

本研究通過凝血因子的多點稀釋分析方法(MDA)的原理,根據樣本曲線和標準曲線的關系,評價了MDA作為篩查抗因子抗體或狼瘡抗凝的實驗的診斷性能。首先通過收集20份正常人混合血漿,配置不同比例的FⅧ濃度,通過MDA方法測定FⅧ含量,觀察標本曲線和標準曲線的關系,結果證實了在FⅧ因子缺乏時,濃度FⅧ在100%,80%,60%,40%,即 FⅧ>10%,二者曲線是平行的；當FⅧ≤10%,雖然不存在病理性抗凝物質,但是二者曲線也出現不同程度的交叉,可能與儀器的性能檢測有關,此時斜率一般在0.9-1.0之間,與存在病理性抗凝物質的斜率有所不同[6,11]；當因子極度缺乏時,如FⅧ<1%,樣本曲線幾乎與X軸平行,提示因子的含量很少基本不隨稀釋度的改變而變化。

其次,本研究分別評價了MDA和MDA聯合血漿糾正試驗在篩查抗FⅧ抗體或狼瘡抗凝物質篩查實驗的效能,MDA作為診斷抗因子抗體實驗的效能敏感度80%,特異性68.3%,陽性預示率38%,陰性預示率93%,與血漿糾正實驗聯合時,其特異性明顯增加,特異性87%。那么,MDA作為診斷狼瘡抗凝物實驗的效能敏感度71%,特異性63.6%,陽性預示率23%,陰性預示率93%,準確率64.7%,聯合血漿糾正實驗篩查LAC抗體,特異性大大增加,特異性81%。因此,MDA可以作為篩查病理性抗凝物質的方法,但是MDA與血漿糾正實驗聯合應用可以更好的篩查病理性抗凝物質并且判斷抗凝物質的種類。

因此,日常工作中我們可以充分利用全自動化凝血儀器上的MDA功能,通過選擇多點稀釋的方法測定凝血因子含量,不僅可以排除病理性抗凝物質的干擾,準確測定患者體內凝血因子含量,而且通過曲線的交叉模式,可以快速、簡便、準確判斷樣本中是否存在病理性抗凝物質,為臨床早期診斷和治療提供更多、更準確的實驗室診斷依據,同時也是對不能開展病理性抗凝物質定量檢測的實驗室的補充。