白脈軟膏含藥血漿對大鼠退變滑膜細胞和軟骨細胞共培養體系的作用及機制研究

蔣鼎， 丁道芳， 韓大鵬， 翟偉韜， 歐陽桂林， 薛艷， 薛喬， 曹月龍

（1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院骨傷研究所，上海 201203；3.上海中醫藥大學康復學院，上海 201203；4.上海中醫藥研究院光華關節炎研究所，上海 200052；5.西藏奇正藏藥股份有限公司，西藏 860000）

骨關節炎是一種以關節軟骨退行性變和繼發性骨質增生為特征的慢性關節疾病，累及關節軟骨乃至整個關節，包括軟骨下骨、關節囊、滑膜和關節周圍肌肉。骨關節炎病程所涉及的結構中，究竟是何處最早出現病變并導致骨關節炎的問題一直存在爭議。近年有不少研究[1-4]表明，滑膜炎癥在骨關節炎中起到了重要的作用，滑膜炎在不同程度的骨關節炎患者中皆存在，包括一些僅有前期癥狀的患者，且滑膜炎與骨關節炎患者疼痛程度以及病情進展有著密切關系。根據不斷出現的新的證據，有學者提出滑膜的病變在骨關節炎中也許是病起源頭而非以往所認知的病發結果[5]。

奇正白脈軟膏根據傳統藏醫理論研制而成，具有舒筋活絡功效，含姜黃、肉豆蔻、甘松、陽起石、甘草、人工麝香、干姜、藏茴香、藏菖蒲、花椒、堿花等成分，常用于白脈病、癱瘓、偏癱、筋腱強直、外傷引起的經絡及筋腱斷傷、手足攣急、跛行等病癥。既往有研究顯示，白脈軟膏對骨折愈合、關節扭傷、筋膜炎等疾病有肯定的療效[6-9]，但其對關節炎的治療作用則需進一步研究。探究退變滑膜細胞對軟骨細胞形態、基因表達變化的影響，有助于了解關節炎病程，因此，本研究應用滑膜—軟骨共培養體系探討骨關節炎病理過程以及白脈軟膏對其干預作用，以期為其臨床防治骨關節炎提供可靠的實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物新生SD大鼠8只，體質量（200±20）g，雄性，SPF級，購自上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，動物質量合格證號：SCXK（滬2013-0016）。

1.2主要藥物、試劑與儀器奇正白脈軟膏（西藏奇正藏藥股份有限公司，批號：151036）；扶他林軟膏（北京諾華制藥有限公司，批號：VP0756）。脂多糖（LPS）（美國Sigma公司）；胎牛血清、1640培養基、青鏈霉素混合液（100×）、2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化液（法國Biowest公司）；白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（臺灣Arigo公司）；PCR試劑盒（美國Selleck公司）；基質金屬蛋白酶13（MMP13）、磷酸化核因子κBp65（p-NF-κBp65）、Ⅱ型膠原（COL2A1）抗體（美國 MP Biomedicals公司）。SIGMA離心機（德國Sigma公司）；多功能酶標儀（美國BioTek公司）；TDZ4-WS離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；CO2恒溫培養箱（Thermo scientific）；IX41顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3白脈軟膏、扶他林軟膏含藥血漿的制備方法給予大鼠背部剃光毛，將藥膏涂于大鼠背部，大鼠每日藥量依據文獻[10]按照體表面積折算公式進行換算：大鼠每日藥量=成人（70 kg）每日藥量×0.018=200 g，每日2次，連續3 d。第3 d第2次涂完1 h后，按每100 g大鼠體質量注射0.15 mL（45 μg/g）的戊巴比妥鈉，深度麻醉后沿腹部正中線打開腹腔，暴露腹主動脈；應用10 mL一次性注射器緩慢抽吸腹主動脈血，轉移到15 mL無菌一次性抗凝離心管中室溫靜置2 h，3 000 r/min離心20 min，吸取上層血漿，-80℃保存備用[11]。

1.4滑膜細胞與軟骨細胞的分離與培養將8只新生24 h SD大鼠用體積分數75%乙醇浸泡5 min后麻醉處死，取出四肢關節處滑膜、軟骨組織。將滑膜組織剔除脂肪、血塊，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次；將標本移入另一新的培養皿中，剪碎滑膜組織，大小不超過1 mm3，吸取滑膜組織點狀接種于25 cm2培養瓶底壁，均勻排列，將培養瓶豎立放置；加入5 mL完全培養基，蓋上瓶蓋，豎立放于37℃、體積分數5%CO2的培養箱中培養4 h，翻轉培養瓶，水平放置培養；每3 d更換1次培養基，待細胞單層長滿70%～80%后，2.5 g/L胰酶消化，傳代。取3～5代生長較好的細胞用于后續實驗。軟骨組織采用本研究所已成熟的軟骨細胞培養方法[12]，0.1%的Ⅱ型膠原酶消化1 h，重復3～4次，收集消化的細胞懸液，1 000 r/min，離心10 min后取細胞沉淀，培養于含體積分數10%胎牛血清的培養基中。

1.5 LPS誘導滑膜細胞退變及滑膜細胞形態觀察打開大鼠膝關節腔，取出滑膜組織，Ⅰ型膠原酶消化2～3 h，1 000 r/min離心10 min，培養于含體積分數10%胎牛血清的培養基中。待細胞鋪滿皿底，胰酶消化傳代培養，取第1代（P1）細胞進行實驗。加入LPS（質量濃度為1 μg/mL）誘導滑膜細胞退變，24 h后在倒置顯微鏡下觀察滑膜細胞的密度與形態。

1.6ELISA檢測滑膜細胞上清IL-1β、TNF-α表達分別設立空白組、模型組、西藥組、白脈組。空白組：正常滑膜細胞（無LPS誘導）；模型組：退變滑膜細胞（LPS誘導）；西藥組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+扶他林軟膏血漿干預；白脈組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+白脈軟膏血漿干預。收集各組細胞上清液，ELISA檢測IL-1β和TNF-α表達。具體操作步驟：將樣品和配制好的標準品加入96孔板中，標準品及樣品均做復孔，每組設3個復孔，重復1次；36℃溫育1.5 h；Wash Buffer洗滌5次；標準品和樣品孔中分別加入抗體結合物，36℃溫育1 h；重復洗滌5次；加入鏈酶親和素—HRP，36℃溫育30 min；重復洗滌5次；加入TMB試劑，36℃避光溫育15 min；加入終止液，終止反應（孔中溶液由藍色轉為黃色）；立即以450 nm波長依序測量各孔的吸光度；根據標準品濃度計算出各樣本濃度。

1.7退變滑膜細胞和軟骨細胞共培養體系及軟骨細胞形態學觀察LPS誘導滑膜細胞24 h后，撤掉LPS；按常規細胞共培養技術方法將誘導后的大鼠滑膜細胞與大鼠軟骨細胞分別接種于Transwell小室的上室和下室，再于細胞培養箱中常規培養。分別設立空白組、模型組、西藥組、白脈組。空白組：正常滑膜細胞（無LPS誘導）+正常軟骨細胞+正常大鼠血漿干預；模型組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+正常軟骨細胞組+正常大鼠血漿干預；西藥組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+正常軟骨細胞+西藥（扶他林軟膏）血漿組干預；白脈組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+正常軟骨細胞+白脈血漿干預。培養24 h后，觀察軟骨細胞形態。

1.8實時定量PCR（qPCR）檢測共培養體系中MMP3、TNF-α、ADAMTS4、Sox9基因表達退變的滑膜細胞和軟骨細胞共培養24 h后，抽提各組共培養體系中的軟骨細胞總RNA及濃度測定，取2 μg RNA逆轉錄，進行qPCR檢測。每個樣品設置3個復孔，實驗重復3次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因，2-△△CT方法可用于定量PCR實驗來計算基因表達的相對變化（p），見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.9Western blot法檢測各組共培養體系中軟骨細胞MMP13、p-NF-κBp65、COL2A1的表達情況首先收集蛋白樣品：原代細胞培養24 h后裂解細胞和蛋白濃度測定，蛋白變性后備用。蛋白樣品電泳和轉膜；體積分數10%BSA室溫封閉1 h；一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗膜4次，每次10 min；二抗（1∶20 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min；化學發光法檢測，X膠片曝光顯影，采用Image J圖像分析管理系統對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.10統計方法采用SPSS 18.0軟件進行數據分析，所有數據以均數±標準差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1退變滑膜培養及指標檢測

2.1.1 滑膜細胞形態觀察 培養24 h后，正常滑膜細胞呈多角形（見圖1-A），經LPS誘導后滑膜細胞形態明顯變細長，呈長梭形（見圖1-B）。

圖1 倒置顯微鏡觀察滑膜細胞形態（×100）Figure 1 The morphological features of synoviocytes under inverted microscope（×100）

2.1.2 滑膜細胞上清中IL-1β、TNF-α含量 表2結果顯示：與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，白脈組IL-1β、TNF-α含量均顯著降低（P＜0.05），西藥組僅TNF-α含量降低（P＜0.05）。

表2 各組滑膜細胞上清中IL-1β、TNF-α含量比較Table 2 Comparison of the contents of IL-1β and TNF-α in the synoviocyte supernatant in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

表2 各組滑膜細胞上清中IL-1β、TNF-α含量比較Table 2 Comparison of the contents of IL-1β and TNF-α in the synoviocyte supernatant in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組西藥組白脈組F P TNF-α 36.645±9.592 62.793±6.716①43.815±4.904②38.787±7.699②5.283 0.015 IL-1β 38.711±6.209 53.055±7.569①46.599±6.369 40.308±3.278②3.256 0.059

2.2共培養體系中退變滑膜細胞對軟骨細胞的影響

2.2.1 共培養體系中軟骨細胞形態 共培養24 h后觀察軟骨細胞形態。圖2結果顯示：與空白組比較，其余3組細胞形態明顯細長，呈長梭形改變；與模型組比較，白脈組、西藥組軟骨細胞形態無明顯差異。

2.2.2 共培養體系中軟骨細胞基因表達 qPCR法檢測各組軟骨細胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4、Sox9 mRNA表達。圖3結果顯示：與空白組比較，模型組軟骨細胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表達明顯升高，Sox9 mRNA表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，白脈組、西藥組MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表達降低，Sox9 mRNA表達升高（P＜0.05）。

圖2 倒置顯微鏡觀察各組軟骨細胞形態（×100）Figure 2 The morphological features of chondrocytes under inverted microscope（×100）

2.2.3 共培養體系中軟骨細胞蛋白表達 Western blot法檢測各組共培養體系中軟骨細胞MMP13、p-NF-κBp65、COL2A1蛋白的表達情況。圖4結果顯示：與空白組比較，模型組MMP13、p-NF-κBp65表達升高，COL2A1表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，白脈組MMP13、p-NF-κBp65表達降低，COL2A1表達升高（P＜0.05），西藥組僅COL2A1表達升高（P＜0.05）。

圖3 各組軟骨細胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4、Sox9 mRNA表達比較Figure 3 Comparison of the mRNA expression levels of MMP3，TNF-α，ADAMTS4，and Sox9 in the chondrocytes of various groups

3 討論

生理情況下，為維持軟骨結構的完整，內環境中分解性細胞因子和合成性細胞因子共同作用，二者在體內維持著分解代謝與合成代謝的動態平衡，而滑膜炎癥則打破了內環境的平衡從而導致進一步的軟骨侵蝕[13]。骨關節炎進程中的起關鍵作用的細胞因子如IL-1β、TNF-α在滑膜及軟骨處皆檢測出大量表達[13-15]。諸多證據[4，5]提示，滑膜炎可能先于關節軟骨的破壞，為骨關節炎進展的前驅，滑膜退變和軟骨退變互相影響形成“滑膜—軟骨”軸，滑膜退變是骨關節炎發病的重要因素。本研究觀察了退變滑膜細胞對體外培養大鼠軟骨細胞的形態、基因表達的影響，在此基礎上進一步觀察了白脈軟膏對“滑膜—軟骨”軸的干預作用。

圖4 各組軟骨細胞MMP13、p-NF-κBp65、COL2A1蛋白表達比較Figure 4 Comparison of the protein expression levels of MMP13，p-NF-κBp65，and COL2A1 in the chondrocytes of various groups

IL-1β和TNF-α是與骨關節炎密切相關的炎癥指標[16]。本研究結果顯示，經LPS誘導的滑膜細胞在形態上出現明顯的成纖維樣改變，滑膜細胞上清中IL-1β和TNF-α含量升高，白脈含藥血漿可有效下調IL-1β和TNF-α含量。表明LPS誘導后加重了滑膜細胞炎癥反應，其形態變化亦與滑膜細胞退變進程符合，而白脈含藥血漿能抑制滑膜細胞炎癥反應以及退變進程。

骨關節炎發病機制復雜，涉及關節及周圍組織多種病理改變，這些病變相互影響并促進了疾病的發展，為了研究其病理機制尚需要提供與體內環境相似的細胞培養環境。細胞共培養體系可模擬體內環境，常應用于骨科相關病理基礎研究中[17]。軟骨基質的主要成分有水、膠原和蛋白多糖。Ⅱ型膠原（COL2A1）是關節軟骨的主要結構成分，MMP3與MMP13皆屬于基質降解酶，MMP13被證實為Ⅱ型膠原最有效的降解酶，而IL-1β、TNF-α是軟骨降解的有效激活物[16]。聚蛋白多糖酶家族（ADAMTS）為A-can退變的重要影響因素，ADAMTS4被證實與骨關節炎的發展密切相關[18]。Sox9基因能調控軟骨細胞Ⅱ型膠原和蛋白多聚糖的表達，抑制軟骨降解的作用[19]。NF-κB是廣泛存在于真核細胞內的一個核轉錄因子，其在骨關節炎炎癥反應及疾病發生發展過程中起重要作用，與軟骨降解和關節損傷密切相關[20，21]。退變滑膜細胞與軟骨細胞共培養實驗結果顯示，與空白組比較，模型組軟骨細胞表現出明顯的形態變化，細胞逐漸細長，呈長梭形改變。軟骨細胞失去原有形態特征，這與骨關節炎病程中關節軟骨發生成纖維化與肥大化改變一致。與模型組比較，西藥組、白脈組軟骨細胞的形態無明顯差異。提示軟骨細胞與退變滑膜細胞共培養后發生退變，扶他林軟膏、白脈軟膏含藥血漿對此形態變化未顯示出明顯的抑制作用。PCR結果顯示：與空白組比較，模型組軟骨細胞MMP3、ADAMTS4、TNF-α mRNA表達上調，Sox9mRNA表達下調；與模型組比較，白脈組軟骨細胞明顯抑制MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表達，并上調Sox9 mRNA表達。說明退變滑膜細胞促進了軟骨細胞退變，加重了骨關節炎的病理進展，提示“滑膜—軟骨”軸對骨關節炎起促進作用，而白脈含藥血漿對此病理過程有明顯抑制作用。Western blot結果顯示：與空白組比較，模型組MMP13、p-NF-κBp65蛋白表達上調，明顯抑制COL2A1蛋白表達；與模型組比較，白脈組MMP13、p-NF-κBp65表達上調，COL2A1表達下調。表明白脈軟膏含藥血漿可能通過抑制p-NF-κBp65表達，減輕骨關節炎炎癥反應，調控“滑膜—軟骨”軸，從而抑制軟骨破壞。提示白脈軟膏有明顯的軟骨保護作用，對“滑膜—軟骨”軸起抑制作用。

從白脈軟膏配方組成來看，姜黃破血行氣、通經止痛，肉豆蔻溫中止痛，甘松行氣止痛，麝香活血止痛，干姜、茴香散寒止痛，藏菖蒲散熱消腫，花椒散寒祛痹，陽起石補虛祛痹，甘草調和諸藥、緩急止痛。諸藥合制，共奏活血止痛、舒筋消腫之效。其舒筋活絡止痛的功效亦與骨關節炎中醫臨床治療相對應。

綜上所述，“滑膜—軟骨”軸中滑膜細胞的變化在滑膜病變中起著重要作用，其退變可影響軟骨細胞形態及基因表達，滑膜的退變可促進骨關節炎的發展。白脈軟膏對“滑膜—軟骨”軸有著明顯的抑制作用，其作用機制可能與減輕滑膜細胞炎癥反應，抑制軟骨細胞NF-κB活化，降低“滑膜—軟骨”軸中各降解性細胞因子的表達有關。