克里米亞-剛果出血熱病毒反向遺傳學系統的開發及應用

任南潔，趙路，袁志明，夏菡

中國科學院 武漢病毒研究所，湖北 武漢430071

CCHFV的基因組結構和其他布尼亞病毒類似，由3節段負鏈RNA組成，分別是小片段（S）、中片段（M）、大片段（L），它們分別編碼病毒的核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）、糖蛋白前體（glycoprotein precursor，GPC）和病毒RNA 依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）[5]。每個基因組片段中都包含1個開放讀框（open reading frame，ORF），ORF的兩端為非翻譯區（untranslated region，UTR）。其中，L片段的基因組最大（～12 kb），遠大于布尼亞病毒目中其他病毒的L片段，其編碼的RdRp 由4000 多個氨基酸殘基組成，相對分子質量約為450×103。除RdRp的活性外，L片段編碼的蛋白還含有1個OTU（ovarian tumor，卵巢腫瘤）結構域，可能與病毒逃逸宿主的先天免疫有關。M片段約為5.4 kb，其轉錄翻譯首先合成糖蛋白前體，然后在宿主來源的多種蛋白酶的作用下，剪切加工為病毒包膜上的糖蛋白GN和GC，以及非結構蛋白mucin、GP38、NSM的前體[6]。GN和GC含有中和抗原決定簇，在病毒吸附和侵入宿主細胞的過程中起重要作用，能誘導中和抗體產生[7]，而具有這種免疫原性的M片段的快速突變和頻繁重排已有報道[8]。S片段大小為1.6 kb，編碼NP 蛋白和1個非結構蛋白（nonstructural proteins，NSs），NP 蛋白可以將病毒RNA和cDNA 包裝為核糖核蛋白顆粒（ribo?nucleoprotein particles，RNPs），并與病毒mRNA的5'UTR 以高親和力結合，然后促進mRNA 翻譯[9]。

CCHFV基因組的S、M和L片段ORF 兩端的UTRs 足以用于病毒小基因組RNA的轉錄、復制和包裝[10]。UTRs 由可變區和高度保守的末端區域組成，末端保守的核苷酸能互補形成非共價閉合的二級結構，與病毒聚合酶進行相互作用。

反向遺傳學技術是以生物基因為主要研究對象，基于對基因核苷酸序列的人為操作，探索基因調控的分子機制以及生命發生發展的本質現象和規律等[11]。反向遺傳學系統可使我們設計病毒個別基因的特定突變，從而研究各個基因在病毒復制、轉錄、裝配和致病方面的具體功能。目前對于CCHFV 還有很多問題待厘清，CCHFV的反向遺傳學系統能極大地便于研究該病毒的復制循環、包裝釋放、宿主免疫入侵、病毒與宿主的相互作用機制等問題。RNA病毒的反向遺傳學系統需要在cDNA 水平上操作基因，將其轉染細胞后，拯救出具有感染性的活的子代病毒（野生型或突變型）[12]。但是，負鏈RNA病毒的基因組RNA在宿主細胞體內不能啟動感染循環，只有病毒的基因組RNA與NP、磷酸化蛋白以及RdRp共同形成功能性的RNP 之后，才具有感染性，因此負鏈RNA病毒反向遺傳學系統的建立十分復雜困難[11]。而CCHFV 由于其編碼RdRp的L片段遠大于其他布尼亞病毒，故其反向遺傳學系統的構建難度極大，自2003年成功構建CCHFV 小基因組系統開始，經過10 多年的發展，直到2015年才構建出CCHFV的全病毒拯救系統。

本文綜述了CCHFV 反向遺傳學的研發歷史及現狀，并簡介了CCHFV 反向遺傳系統在病毒功能基因、藥物篩選和疫苗研制中的應用。

1 CCHFV 反向遺傳系統研究進展

1.1 CCHFV 小基因組系統的建立

2003年，Flick等建立了CCHFV的小基因組（minigenome）系統。他們利用人和鼠的RNA 聚合酶Ⅰ（polⅠ）的啟動子構建了帶有人工病毒RNA基因組片段的轉錄質粒，基因組片段又包含了病毒RNA 或其互補正義鏈、報告基因[綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、氯霉素乙酰轉移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）]，以及病毒S片段的非編碼區（non-coding regions，NCRs）。將該質粒轉染不同的真核細胞后，可在細胞中觀察到報告基因的表達，并且在病毒傳代后，報告基因依然表達，證實了polⅠ系統可驅動小基因組的包殼、轉錄和復制，并且可將小基因組包裝為具有感染能力的子代病毒（圖1A）。該系統首次證明了polⅠ系統可用于布尼亞病毒的反向遺傳學系統建立，并且提供了研究CCHFV 生物學功能和預防治療措施的新途徑[13]。但是，由于這一系統依賴于CCHFV 輔助病毒，導致它的應用依舊局限于高等級生物安全實驗室中，并且無法對病毒的L片段和S片段進行更深入的研究。

2010年，Bergeron 等構建了一個不依賴于CCHFV 輔助病毒的高效反向遺傳學系統。他們構建了帶有T7 啟動子的S、L片段ORFs的表達質粒，和帶有GFP 或Gaussia 螢光素酶（Gluc）報告基因的小基因組，轉入可穩定表達T7 RNA 聚合酶的BSR-T7細胞，得到了具有復制能力，但不具有感染能力的病毒RNA（圖1B）[10]。這是正內羅病毒家族成員中第一個不依賴于輔助病毒的小基因拯救系統，雖然該系統依然未能成功獲得具有感染能力的病毒，但是可以對CCHFV的L和S片段以及RNA 模板進行基因修飾，進而研究病毒的轉錄、復制和包裝機制。

2013年，趙九如等建立了一套不依賴輔助病毒，基于增強綠色熒光蛋白（enhanced GFP，EGFP）報告基因的CCHFV 小基因組拯救系統。他們將帶有S、L片段ORFs的輔助質粒，和帶有S/M/L片段的UTRs 以及報告基因EGFP的小基因組共轉染細胞，之后在熒光顯微鏡下觀察到了綠色熒光，證明該小基因組拯救成功（圖1B）[14]。

1.2 進入和轉錄能力的病毒樣顆粒（transcriptionand entry-competent virus-like particle，tecVLP）

2015年，Bergeron 嘗試了CCHFV tecVLP系統的建立。病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）在形態學上與病毒相似，具有轉錄和進入細胞的能力，但是不能表達病毒蛋白，所以只能模擬病毒單周期感染，無法產生感染性病毒，故可以在BSL-2 實驗室中進行研究。VLP 應用廣泛，可用于抗病毒藥物篩選，檢測單克隆抗體效力，確定病毒重組的潛在分子決定因素，制作疫苗等。

1.2 診斷標準 兩組患者均符合《中華外科雜志》編委會、中華醫學會外科分會肛腸外科學組2000年制定的《痔診治暫行標準》。

圖1 CCHFV小基因組系統

Bergeron 對傳統VLP 進行了改進，將CCHFV的NP 蛋白序列、密碼子優化過的GPC 序列以及L蛋白序列分別連接在表達載體上，再加帶有噬菌體T7 聚合酶的表達載體，和帶有NanoLuc 螢光素酶（nanoluciferase）的小復制子，共5個質粒，共轉染哺乳動物細胞，最終拯救出tecVLPs，并證明生成的tecVLPs與野生型CCHFV的形態一致，大小相對均勻（94±3 nm），可有效中和CCHFV 特異性單克隆抗體與藥物，并且證實了生成的tecVLPs能且只能感染細胞1 次（圖1C）[5]。這一tecVLP系統是一種安全、可靠、有效的分子研究方法，有助于在BSL-2 實驗室中開展CCHFV 高通量藥物篩選、抗體評估、感染分子機制等方面研究。

1.3 CCHFV 全病毒拯救系統的建立

在最初CCHFV 小基因組的拯救中，使用了輔助病毒進行共感染或雙重感染，但是由于攜帶工程化基因組的病毒顆粒很難從輔助病毒中分離出來，因此建立反向遺傳學系統的最終目的是創建僅含質粒或RNA、無需輔助病毒的反向遺傳學系統[12]。但由于CCHFV的L片段過大，轉染表達效率低，難以拯救，其全病毒拯救系統于2015年才陸續建立。

Bergeron 等首先于2015年嘗試了利用T7系統的小基因組來拯救野生型CCHFV，但發現僅將帶有T7 啟動子的S、M、L片段的質粒共轉染細胞并不能拯救病毒，原因可能是過長的L片段降低了重組RNPs的效率，或是L片段的mRNA在細胞核中發生異常剪接或提前終止。所以他們將L片段進行了密碼子優化來替代野生型，轉染細胞后檢測到了L片段復制的熒光信號，隨后通過調整各質粒比例，獲得了具有感染性的重組CCHFV（圖2 右）。這一技術將有助于研究CCHFV的復制周期、發病機制和傳播[15]。

2017年，Stephen 等在Bergeron的基礎上，將S片段替換為ZsGreen1（ZsG）熒光蛋白基因，拯救出帶有報告基因的重組病毒（圖2 左上），可用于藥物篩選[16]。

2018年，夏菡等將NanoLuc基因與CCHFV M片段上的mucin 編碼框融合，拯救出可分泌表達NanoLuc 螢光素酶的重組病毒（圖2 左下）[17]。Na?noLuc 螢光素酶是目前性能最好的生物發光報告基因之一，其亮度比螢火蟲螢光素酶（luciferase）高240倍，而大小僅為GFP的三分之二，可以最大限度地減少外源基因對病毒的干擾[18]。

圖2 CCHFV全病毒拯救系統

2 CCHFV 反向遺傳系統的應用

2.1 用于病毒基因功能的研究

CCHFV 異常巨大的L片段編碼的L 蛋白組成復雜，研究發現其N端存在一些非經典L 蛋白功能的結構域，是在其他布尼亞病毒的基因組中未發現的。L 蛋白的第1～169 位氨基酸殘基已被證明足以去除泛素（Ub）和類泛素蛋白[10]，在正鏈和負鏈RNA病毒的研究中，都曾發現具有相似活性的病毒OTU 域，其表達的去泛素化酶可以水解病毒的多聚蛋白，是某些病毒復制所必需的。而Bergeron 等通過突變L 蛋白OTU 域的活性位點，構建了L-OTU 蛋白酶失活的變體小基因組，將其轉染細胞后并未發現突變體與野生型之間的差別，說明病毒RdRp的活性不受OTU 蛋白酶活性的影響，OTU 蛋白酶的活性對病毒RNA的復制并不是必需的[19]。

2013年，趙九如等利用建立的重組CCHFV 拯救系統，發現L、M、S 兩端的UTRs在小基因組的表達中是必不可少的，并且L、M、S片段的UTRs活性水平呈逐漸降低的趨勢。經系統分析，LUTRs 可以耐受某些核苷酸的突變，M-UTRs與其ORFs 具有相似的進化樹結構，S片段的5'UTRs與ORFs的進化樹幾乎相同，而3'UTRs 則形成了新的分化群。這一系統為研究CCHFV 復制周期、致病機制和進化模式提供了基礎[14]。

2.2 用于抗病毒藥物的篩選和鑒定

因為CCHFV 屬于第一類病原微生物，缺乏可用于生物安全二級實驗室的高通量藥物篩選系統，極大地限制了對其藥物的研發和評估，而CCHFV 小基因組系統的建立正好解決了這一問題。

2010年，Bergeron利用他們構建的基于T7啟動子系統的CCHFV 小基因組系統，發現利巴韋林可以通過抑制細胞RNA 聚合酶的活性，來抑制小基因組報告基因蛋白的合成，從而抑制CCHFV的小基因組的復制，證明利巴韋林對CCHFV的作用是特異性的，也說明該系統可以用于抗病毒藥物的篩選[10]。這種方法相對于使用活的CCHFV的主要優點之一是不需要在高等級生物安全實驗室中進行試驗，極大地促進了CCHFV 抗病毒藥物篩選的發展。但是，關于利巴韋林的效果在隨后的研究中也有較大爭議，有研究表明利巴韋林在感染早期使用有臨床效果[20]，但也有分析提示利巴韋林的療效較差且不穩定[21-23]。

2017年，Stephen 等利用構建的含報告基因的CCHFV/ZsG，建立了一種高通量篩選CCHFV 抗病毒藥物的方法。該方法通過檢測受感染細胞的熒光減少量來量化抗病毒化合物的病毒抑制效果。之后，他們發現2'-脫氧-2'-氟胞苷的抗病毒效果是利巴韋林的200倍，且與法匹拉韋（favipi?ravir）有協同作用，可以抑制CCHFV的復制而不引起細胞毒性[16]。這一發現不僅建立了利用報告病毒來高通量篩選抗病毒藥物的方法，可以更快速地確定有效治療方案，而且也可以用于CCHFV生命周期的研究。

2018年，夏菡等利用拯救出的可分泌表達NanoLuc 螢光素酶的重組病毒，對比了弗林蛋白酶抑制劑與利巴韋林的抗病毒效果，發現弗林蛋白酶抑制劑的效果差于利巴韋林，不適合作為CCHFV的抗病毒候選藥物繼續進行深入評估，但也證實該系統可用于抗病毒藥物的體外快速初篩，為抗CCHFV 藥物研發提供了技術支持[17]。

后2種系統均使用了帶有報告基因的重組病毒，仍然需要在高等級生物安全實驗室中操作，所以這也制約了其使用范圍。

2.3 用于疫苗候選株的研究

目前，CCHFV 還沒有獲準使用的有效的預防疫苗，其惟一的疫苗是一種滅活病毒制劑，但由于其安全性問題，僅在保加利亞投入使用，并未在其他高危人群國家中獲準使用[24-25]。

由于M片段編碼的GPC 蛋白已被證明其產生的免疫反應對小鼠有重要的保護作用[26]，所以疫苗研發大多圍繞GPC 蛋白展開。2017年，Aura等構建了編碼M片段糖蛋白前體基因的DNA 疫苗結構，并對其在哺乳動物細胞中的表達進行了優化。隨后，他們利用之前構建的CCHFV的VLP比較和量化了優化后的DNA 疫苗在2個具有相同遺傳背景的小鼠模型實驗中的體液反應和保護效果，發現密碼子優化過的M片段DNA 疫苗具有較高的免疫原性，且可以在2種小鼠模型中都產生CCHFV 特異性的免疫反應及中和性抗體。雖然具體保護機制尚不清楚，且該疫苗是否能對基因距離較遠的CCHFV 毒株提供交叉保護性免疫仍有待觀察，但該研究為進一步了解CCHFV DNA 疫苗的保護能力提供了依據，并將有助于開發更加有效的CCHFV 疫苗[27]。

3 結語

反向遺傳學作為一門新興的分子生物學研究方法和技術，極大地推動了病毒學研究的發展，以往經典遺傳學無法解決的問題，借助反向遺傳學這一技術平臺都可以被較好地揭示[28]。而CCHFV 作為第一類病原微生物，其反向遺傳學的研究受實驗條件的限制而發展緩慢，歷經10 余年才終于完成全病毒的拯救。該系統不僅為CCH?FV 分子生物領域的研究提供了良好的工具，便于開展基因功能以及病毒致病機制等方面的研究，而且在抗病毒藥物篩選和新型疫苗開發等實際應用方面都具有極大的價值。但是，目前關于CCHFV 反向遺傳學仍有許多問題，如某些病毒蛋白的重要功能、病毒毒力的決定性遺傳因素、病毒基因組UTR 區域對病毒復制轉錄的影響機制、合理且可用于臨床的疫苗，以及疫苗實驗動物模型的建立等，這些問題仍需要進一步探討來給予合理解釋。