circCMTM3通過海綿miR-588調控細胞遷移和侵襲

張增亮，張迎龍，李南

解放軍總醫院 第四醫學中心骨科，北京100048

骨肉瘤是一種惡性腫瘤，最常見于兒童和青少年四肢長骨干骺端[1]。即使通過手術和新輔助化療，治療效果也只達60%～70%的生存率[2-4]，其中有轉移和化療耐藥的患者存活率很低[5]。因此，需要新的生物靶點或分子機制來提高骨肉瘤治療的療效。環狀RNA（circRNAs）具有保守性、穩定性、差異性及豐富性等特征，是在臨床和醫學研究中得到廣泛認可的一種有用的生物標志物。circRNAs 可以充當miRNA海綿，是一種競爭miRNA和長鏈非編碼RNA的新型內源性RNA。隨著新一代測序和生物信息學分析的應用，更多的研究發現circRNAs 參與多種疾病進展，尤其是腫瘤的發生。研究報道，通過沉默circCMTM3（hsa_circ_0008450）可以調控miR-214-3p/EZH2 軸來抑制肝癌的進展[6]；circCMTM3 還可以通過靶向miR-577 上調CXCL9的表達，促進鼻咽癌細胞的增殖和侵襲[7]。本研究旨在探究circCMTM3在骨肉瘤細胞中的表達情況以及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

成骨細胞hFOB1.19，骨肉瘤細胞Huo9、G-292和Saos2 來自美國ATCC；pmirGLO 質粒購自上海柯雷生物科技有限公司；pLCDH-ciR 載體購自廣州吉賽生物科技有限公司；10%胎牛血清和DMEM 培養基購自Sigma 公司；miR-588 mimics 或siRNA 來自廣州市銳博生物科技有限公司；Lipo?fectAMINE 2000 轉染試劑、TRIzol 試劑盒購自In?vitrogen 公司；CCK-8 試劑購自GlpBio 公司；雙螢光素酶報告試劑盒購自Promega 公司；Transwell 小室和Matrigel 基質凝膠購自BD 公司；反轉錄試劑盒、SYBR green PCR mix、96 孔板、流式細胞分析試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司；HRP 試劑、RIPA 緩沖液和PMSF 購自Solarbio 公司；PVDF膜購自Millipore 公司；流式細胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2 細胞培養與轉染

細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養基，于5% CO2、37℃恒溫培養箱中培養。將circCMTM3的497 bp 序列長度構建至pLCDH-ciR 載體中，以空載體為對照，將載體分別轉染骨肉瘤細胞，利用嘌呤霉素篩選細胞。通過LipofectAMINE 2000將miR-588 mimics 或siRNA 轉染骨肉瘤細胞。

1.3 RNA 提取和qRT-PCR

TRIzol 法提取細胞總RNA，并利用反轉錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR green PCR mix 進行qRT-PCR。U6和肌動蛋白（actin）分別為miRNA和mRNA的內參。引物見表1。

1.4 細胞增殖實驗

將轉染后的細胞以1.5×103/孔加入96 孔板，分別37℃恒溫培養24、48、72和96 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的CCK-8 溶液，繼續37℃恒溫培養4 h，酶標儀測定D450nm值。以時間為橫坐標、D450nm值為縱坐標制作增殖曲線。

1.5 細胞遷移和侵襲實驗

1.5.1 Transwell 遷移實驗 將直徑6.5 mm、孔徑8 μm的Transwell 小室放入24 孔板中，上室加入200 μL 濃度為2×103/mL的無血清單細胞懸液，下室加入500 μL 含20%血清的培養基為遷移趨化物，于5% CO2、37℃恒溫培養箱中培養24 h，取出小室，PBS 清洗3 次，用質量分數為0.01%的DAPI 染色，倒置顯微鏡拍照計數。

1.5.2 Transwell 侵襲實驗 從-20℃取出Matrigel膠，4℃冷卻融化，并用4℃預冷的無血清培養基按照1∶3的比例稀釋Matrigel 膠，將稀釋后的溶液加入上室，其余步驟與遷移實驗相同。

1.6 細胞周期和凋亡檢測

取2 mL 濃度為1×106/mL的細胞懸液接種于6 孔板，轉染siRNA。將細胞懸液離心后用70%酒精于-20℃固定24 h，隨后離心并加入RNaseA 去除RNA，再用碘化丙鈉（PI）在黑暗中染色30 min，流式細胞儀測定細胞周期分布。

表1 qRT-PCR引物及序列

收集轉染后的細胞，制作單細胞懸液，離心去上清。加入預冷的PBS 洗滌細胞2 次，去上清，然后加入1 mL 1×結合緩沖液重懸細胞。取100 μL 加入5 mL 培養管中，加入5 μL FITC 標記的AnnexinⅤ和5 μL PI 混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入400 μL 1×結合緩沖液。流式細胞儀分析檢測細胞凋亡。

1.7 螢光素酶報告基因檢測

用LipofectAMINE 2000 將含有野生或突變circCMTM3的pmirGLO質粒和miR-588 mimic 共轉染細胞。48 h后，用雙螢光素酶報告試劑盒測定螢光素酶活性。

1.8 統計學分析

采用GraphPad Prism 7 對實驗數據進行統計學分析，至少3個獨立實驗的數據以x±s表示，統計檢驗數據符合正態分布。2組間差異采用t檢驗，3 組及3 組以上采用方差分析。雙尾值P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circCMTM3在骨肉瘤細胞中的高表達

在不同骨肉瘤細胞中檢測circCMTM3的表達，發現circCMTM3在骨肉瘤細胞中的表達量均高于正常成骨細胞中（圖1）。3種骨肉瘤細胞系中，G-292細胞中的circCMTM3表達最高，因此選用G-292細胞進行circCMTM3 功能檢測。

2.2 沉默circCMTM3 對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響

為了探究circCMTM3在骨肉瘤細胞中的功能，對G-292細胞進行circCMTM3 沉默，隨后通過CCK-8和Transwell檢測，結果如圖2，circCMTM3沉默后，細胞增殖、遷移和侵襲能力均明顯降低。該結果說明circCMTM3 參與骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程，發揮促癌作用。

2.3 沉默circCMTM3 對骨肉瘤細胞周期和凋亡的影響

流式細胞術檢測circCMTM3 是否影響骨肉瘤細胞周期和凋亡情況。結果表明，circCMTM3表達降低使G1 期細胞增加，而S 期細胞減少，敲除circCMTM3 抑制了細胞周期進展，但促進了細胞凋亡（圖3）。這些結果顯示，circCMTM3 促進細胞周期進展，并減少了細胞凋亡。

2.4 circCMTM3 是miR-588的miRNA海 綿

圖1 circCMTM3在骨肉瘤細胞Huo9、G-292、Saos2和成骨細胞hFOB1.19 中的表達

圖2 沉默circCMTM3 影響骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲

研究表明circRNA 常作為miRNA海綿調控miRNA的表達，從而參與細胞功能。通過starBase數據庫預測了含有circCMTM3 結合位點的4 條miRNA，分 別 為miR-4701-5p、miR-588、miR-1224-5p和miR-577。圖4A 結果顯示，circCMTM3敲除對miR-588表達影響顯著，而對其他影響不大。為了進一步驗證circCMTM3和miR-588 兩者的靶向作用關系，我們通過螢光素酶檢測發現miR-588 mimic 顯著降低了正常組（WT）螢光素酶活性，而對突變組（MUT）無影響（圖4C）。miR-588在骨肉瘤細胞中低表達（圖4D），與circ?CMTM3在骨肉瘤細胞中的表達情況相反。綜上，circCMTM3 是miR-588的miRNA海 綿。

2.5 circCMTM3 通過海綿miR-588 促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲

為了檢測miR-588在骨肉瘤中的功能以及對circCMTM3 功能的影響，我們通過過表達miR-588和/或circCMTM3 并檢測骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力發現，單獨過表達circCMTM3 促進了骨肉瘤細胞的遷移和侵襲，單獨過表達miR-588 抑制了細胞的遷移和侵襲，而過表達circCMTM3 消除了miR-588 過表達對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的抑制作用（圖5）。這些結果表明，circCMTM3在骨肉瘤細胞中通過調控miR-588 而起到促癌作用。

圖3 沉默circCMTM3 影響骨肉瘤細胞周期和凋亡

圖4 circCMTM3 是miR-588的miRNA海綿

圖5 circCMTM3 通過海綿miR-588 促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲

3 討論

circRNA 已被鑒定為包括癌癥在內的不同類型疾病的新型生物標志物和潛在的治療靶點。研究顯示circRNA在腫瘤發生、生長和轉移過程中發揮十分重要的作用[8-10]。hsa_circ_0001361 通過miR-491-5p/MMP9 軸促進膀胱癌的侵襲和轉移[11]；hsa_circ_0078710 作為miR-31的海綿，促進肝癌進展[12]。最近的一項研究發現circ_0008450在肝癌組織和細胞中的表達高于相應的非腫瘤組織和細胞系，且circ_0008450 高表達的患者具有嚴重的臨床特征，包括腫瘤大小和TNM 分期較高[13]。本研究結果表明circCMTM3 同樣在骨肉瘤細胞中高表達，circCMTM3的敲除顯著抑制骨肉瘤細胞的生長、遷移和侵襲，并刺激了細胞凋亡。因此，circCMTM3在骨肉瘤中具有促癌作用。

circRNA 可以通過海綿miRNA間接發揮其生物學功能。例如，Li 等發現上調的circ_0016760可以通過miR-1287/GAGE1 軸促進細胞進程[14]；circ-FOXP1 通過海綿化miR-875-3p和miR-421促進肝癌進展[15]。本研究中，我們通過starBase 數據庫預測了可能被circCMTM3 海綿的miRNA分別為miR-4701-5p、miR-588、miR-1224-5p和miR-577，其中只有miR-588的表達顯著受circCMTM3影響。我們通過螢光素酶報告試驗進一步驗證circCMTM3 能夠靶向海綿miR-588。

Zhou 等[16]研究發現miR-588在胃癌中低表達且抑制腫瘤細胞的遷移。Yu 等[17]研究發現miR-588在乳腺癌中也具有抗腫瘤作用，是治療乳腺癌的潛在治療靶點。本研究結果顯示miR-588在骨肉瘤細胞中低表達，并通過回復實驗發現，單獨過表達circCMTM3 促進了骨肉瘤細胞的遷移和侵襲，miR-588 過表達抑制了細胞的遷移和侵襲，而過表達circCMTM3 通過海綿作用抑制miR-588的功能。這些結果表明，circCMTM3的致癌作用部分依賴于其對miR-588的調節，circCMTM3/miR-588p 軸有助于骨肉瘤進展。但miR-588的具體作用機制仍待進一步探討。

綜上所述，circTMCM3在骨肉瘤細胞中高表達，并通過海綿miR-588 發揮致癌作用，這項研究可能為骨肉瘤提供新的潛在治療途徑。