阿托伐他汀對KLF4過表達的RAW264.7細胞表型偏移的影響

李鑫，馬立芝，向國安，李琦，姬文婕，魏路清

1.解放軍總醫院第三醫學中心a.急診科，b.呼吸科，北京100039；2.解放軍總醫院，北京100853；3.武警特色醫學中心 呼吸與重癥醫學科，天津300162

Krüppel 樣因子（Krüppel-like factors，KLFs）是包含鋅指結構的核轉錄因子，在機體多項生命活動中具有重要的調節作用[1]。KLF4 是KLFs 家族眾多成員之一，因其在消化道含量豐富又稱為胃腸富集KLF[2]（gut-enriched KLF，GKLF）。KLF4 能夠與不同的靶基因結合而發揮不同的生物學作用，表現為轉錄激活或抑制。近年來的研究表明，KLF4 能夠參與并調節機體的炎癥反應[3]。巨噬細胞作為機體免疫防御系統的重要組成部分，參與先天性免疫和細胞免疫活動[4-5]。在不同的內環境下，巨噬細胞可分化為具有促炎性的M1型巨噬細胞或抗炎性的M2 型巨噬細胞，參與機體的免疫反應[6]。本課題組在前期研究中發現KLF4在博來霉素致肺纖維化過程中呈明顯的動態變化，同時發現給予阿托伐他汀（atorvastatin，ATO）干預后KLF4的表達也隨之發生改變[7-8]。為進一步探索ATO和KLF4的作用機制，本研究通過體外實驗脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導巨噬細胞表型變化，探討KLF4 對巨噬細胞表型的變化調節與ATO 干預的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型RAW264.7細胞（南開大學生命科學院韓際宏教授惠贈）；KLF4 過表達RAW264.7細胞（Lenti-KLF4）、空載體對照的RAW264.7細胞（Lenti-pLVX）（實驗室前期構建保存[9-10]）；胎牛血清（Gibco 公司）；DMEM 高糖培養基、胰蛋白酶（HyClone 公司）；瓊脂糖、阿托伐他汀（Sigma 公司）；嗎啉代丙烷磺酸（Ambion 公司）；PCR 擴增試劑盒（大連TaKaRa 公司）；TRIzol 試劑盒、Lipo?fectAMINE 3000 試 劑（Invitrogen 公 司）；SYB?RGreen 實時定量PCR 試劑盒（Roche 公司）；引物均由中美泰和生物有限公司合成。

1.2 細胞復蘇及培養

取出野生型RAW264.7細胞、Lenti-KLF4細胞、Lenti-pLVX細胞，迅速復蘇后置于含2 mL 12%高糖DMEM 培養基的六孔細胞培養板中，于37℃，5% CO2的細胞培養箱中繼續培養。

1.3 LPS誘導RAW264.7細胞

分別取對數生長期的RAW264.7細胞接種于12 孔細胞培養板，每孔5×104細胞，1 mL 12%高糖DMEM 培養基，于培養箱中繼續培養21 h，從每孔吸出500 μL 培養基于無菌EP 管中，在實驗組EP 管中加入5 μL LPS 溶液（20 ng/μL），對照組EP 管中加入5 μL 高糖DMEM 培養基，混勻后加回到原細胞培養孔中，繼續培養3 h。

1.4 ATO 干預RAW264.7細胞

分別取處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于12 孔細胞培養板，每孔5×104細胞，1 mL 12%高糖DMEM 培養基，于培養箱中繼續培養18 h，從每孔吸出500 μL 培養基于無菌EP 管中，在對照組EP 管中加入10 μL DMSO，實驗組EP 管中加入10 μL ATO 溶液（10 μmol/mL），混勻后加回到原細胞培養孔中去，繼續培養6 h。

1.5 ATO 干預后，LPS 作用于RAW264.7細胞

分別取處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于12 孔細胞培養板，每孔5×104細胞，1 mL 12%高糖DMEM 培養基，于培養箱中繼續培18 h，從每孔吸出500 μL 培養基于無菌EP 管中，在對照組及LPS 組EP 管中分別加入10 μL DMSO，LPS+ATO 組EP 管中加入10 μL ATO 溶液（10 μmol/mL），混勻后加回到原細胞培養孔中去，繼續培養3 h，從每孔吸出500 μL 培養基于無菌EP管中，在對照組EP 管中加入5 μL 高糖DMEM 培養 基，LPS 組 及LPS+ATO 組EP 管 中 加入5 μL LPS 溶液（20 ng/μL），混勻后加回到原細胞培養孔中去，繼續培養3 h。

1.6 RT-PCR 檢 測KLF4 mRNA的表 達

每組3個樣本，實驗重復3 次。分別提取各組細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，進行PCR 擴增,用2-ΔΔCt法分析擴增結果。引物序列見表1。

1.7 統計學方法

實驗數據采用Stata 14.1 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料用x±s表示，2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS、ATO 分別作用于野生型RAW264.7細胞后KLF4的mRNA表 達

RT-PCR 結果見圖1。 LPS誘導野生型RAW264.7細胞3 h后，KLF4基因的mRNA 相對表達量與對照組相比降低約70%（0.24±0.06 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。ATO 干預野生型RAW264.7細胞6 h后，KLF4基因的mRNA 相對表達量與對照組相比升高約3倍（3.72±0.71 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。

2.2 LPS誘導野生型RAW264.7細胞后，巨噬細胞表型相關基因的mRNA表達

RT-PCR 結果見圖2。 LPS誘導野生型RAW264.7細胞3 h后，與較野生型對照組相比，IL-10、Arg-1基因的mRNA表達量分別低于對照組約84%（0.16±0.02 vs 1.00±0.00）、74%（0.26±0.04 vs 1.00±0.00）（P＜0.05），NF- κB基因的mRNA 相對表達量較對照組升高約1.5倍（1.51±0.21 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。

2.3 ATO 干預后，LPS誘導的RAW264.7細胞表型相關基因的mRNA表達

RT-PCR 結果見圖3。ATO 干預后LPS誘導的RAW264.7細胞，ATO+LPS 組與LPS 組（對照組）相比IL-10、Arg-1基因的mRNA 相對表達量分別高于對照組約1.6倍（1.70±0.16 vs 1.00±0.00）、1.8倍（1.83±0.08 vs 1.00±0.00，P＜0.05)，NF-κB基因的mRNA表達量較對照組降低了約42%（0.58±0.05 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。

圖1 KLF4的mRNA 相對表達

圖2 LPS誘導RAW264.7細胞后IL-10、Arg-1、NF-κB基因mRNA的相對表達

2.4 LPS誘導Lenti-KLF4細胞后，巨噬細胞表型相關基因的mRNA表達

RT-PCR 結果見圖4。LPS誘導KLF4 過表達的RAW264.7細胞后，LPS 組 中，Lenti-KLF4與Lenti-pLVX 相比IL-10、Arg-1、基因的mRNA 相對表達量分別升高約3倍（1.64±0.09 vs 0.56±0.06，P＜0.01）、16倍（4.30±0.29 vs 0.27±0.11，P＜0.01），NF-κB基因的相對表達量降低約60%（1.49±0.30 vs 3.79±0.63，P＜0.05）。在對照組中，Lenti-KLF4與Lenti-pLVX 相比IL-10、Arg-1基因的mRNA 相對表達量分別升高約3.3倍（3.32±0.94 vs 1.00±0.00，P＜0.01）、10.5倍（10.55±2.71 vs 1.00±0.00，P＜0.01），NF-κB基因的相對表達量降低約62%（0.38±0.07 vs 1.00±0.00，P＞0.05）。

圖3 ATO 干預后，LPS誘導的RAW264.7細胞IL-10、Arg-1、NF-κB基因mRNA的相對表達

圖4 LPS誘導KLF4 過表達的RAW264.7細胞IL-10、Arg-1、NF-κB基因mRNA的相對表達

圖5 ATO 干預后，LPS誘導的Lenti-KLF4細胞IL-10、Arg-1、NF-κB基因mRNA的相對表達

2.5 ATO干預后LPS誘導Lenti-KLF4細胞，巨 噬細胞表型相關基因的mRNA表達

RT-PCR 結果見圖5。ATO+LPS 組中，Lenti-KLF4與Lenti-pLVX相比IL-10、Arg-1基因的mRNA 相對表達量分別升高約2倍（2.85±0.41 vs 1.34±0.08，P＜0.01）、3.6倍（9.84±0.96 vs 2.75±0.57，P＜0.01），NF-κB基因的相對表達量降低約55%（0.39±0.09 vs 0.87±0.02，P＜0.01）。LPS 組中，Lenti-KLF4與Lenti-pLVX 相比IL-10、Arg-1基因的mRNA 相對表達量分別升高約1.8倍（1.81±0.52 vs 1.00±0.00，P＜0.05）、7.5倍（7.48±0.95 vs 1.00±0.00，P＜0.05），NF-κB基因的相對表達量降低約23%（0.77±0.12 vs 1.00±0.00，P＜0.05）。

3 討論

單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞共同構成機體的重要防線。巨噬細胞由單核細胞分化而來，其在機體器官內可進一步分化為經典活化的M1表型（主要功能為識別、提呈、促炎）和選擇性活化的M2表型（主要功能為抑炎、修復）[11-12]，在不同免疫反應和疾病環境下，功能相異甚至相互抑制來發揮不同的調控作用。在骨關節炎疾病中，M1和M2 型巨噬細胞參與炎癥反應的發生發展[13]。在非酒精性脂肪肝肝炎疾病中，調節M1 型巨噬細胞的極化可能是潛在的治療靶點[14]。在變態反應性疾病中，Egawa[15]等發現炎癥細胞聚集并通過嗜堿性粒細胞分泌白介素4 調節巨噬細胞向M2 型偏移發揮抗炎作用，從而減輕變態反應。同時，巨噬細胞極化對過敏性哮喘的發病具有深遠影響[16]。在博萊霉素致小鼠肺纖維化中，肺內巨噬細胞明顯由M1表型向M2表型偏移且隨疾病的發生發展呈動態變化[17]。在小鼠矽肺模型中，同樣發現巨噬細胞明顯由M1表型向M2表型偏移且隨疾病的發生發展呈動態變化的現象[18]。

KLF4 作為一種重要的信號蛋白分子，對巨噬細胞的分化成熟具有調控作用，并成為其分化為M1 型和M2 型的標志物[19-20]。KLF4 能夠抑制巨噬細胞向M1表型極化，促進巨噬細胞向M2表型極化[20]。有研究發現，KLF4 能夠調控巨噬細胞極化而作為治療動脈粥樣硬化疾病的一個靶點[21-23]。他汀類藥物在臨床上廣泛應用于調節機體脂類代謝，近年來有研究發現他汀類藥物還具有免疫調節、抑制心肌肥厚、改善內皮功能等作用[24-26]。阿托伐他汀作為常用的他汀類藥物之一，在肺纖維化疾病領域有著廣泛的研究和應用，其也被證實可緩解肺纖維化的進展程度[27-28]。

本研究主要通過LPS誘導RAW264.7細胞，構建體外損傷模型，以探討巨噬細胞表型偏移與他汀類藥物及KLF4的關系。我們的研究結果顯示，LPS 會抑制RAW264.7細胞內KLF4的表達，同時阿托伐他汀會促進RAW264.7細胞內KLF4的表達。有研究證實，在LPS誘導的RAW264.7 巨噬細胞中，阿托伐他汀可以有效抑制TNF-α和iNOS的mRNA表達[29]。本研究中LPS 作用于RAW264.7細胞后，可以抑制巨噬細胞由M1 型向M2 型偏移，與文獻報道一致[30-31]。本研究發現阿托伐他汀干預后，LPS 作用于KLF4 過表達的RAW264.7細胞表型偏移發生部分逆轉。結合前期發現通過抑制部分博萊霉素誘導的小鼠巨噬細胞表型偏移而改善肺纖維化情況[32]及肺纖維化模型中KLF4 含量的動態變化[8]，阿托伐他汀可能通過KLF4 途徑來調節巨噬細胞表型偏移，進而在肺損傷及肺纖維化病理進程中發揮作用。本研究僅通過慢病毒介導KLF4 過表達來探討其對巨噬細胞的表型調控，存在不足之處，還應通過對KLF4敲低以更進一步探討其對巨噬細胞表型的調控。在機體穩態及損傷、炎癥等不同狀態下，巨噬細胞的功能異質性不容忽視，了解阿托伐他汀的可能干預機制，可為我們進一步探索臨床治療肺纖維化等疾病奠定實驗和理論基礎。