炎癥條件下毛狀樣蛋白1促進淋巴細胞與血管內皮細胞的黏附及遷移

駢亞亞，陶鳳蓉，馮敏，聶晶晶，高振祥，胡繼紅

1.北京醫院 國家老年醫學中心 國家衛生健康委臨床檢驗中心，中國醫學科學院 老年醫學研究院；2.北京醫院 檢驗科 國家老年醫學中心，中國醫學科學院 老年醫學研究院；3.北京醫院 風濕免疫科 國家老年醫學中心，中國醫學科學院 老年醫學研究院；北京100730

淋巴細胞是機體參與正常免疫應答及炎癥反應的重要細胞，其發育成熟后向二級淋巴組織進行遷移。高內皮細胞小靜脈（high endothelial venule，HEV）是存在于淋巴結等二級淋巴器官（除脾臟）的后毛細靜脈，是淋巴細胞遷移的重要通道[1-2]。當初始淋巴細胞遇到特異性抗原或有炎癥刺激時，會穿過血管內皮迅速遷移至感染部位行駛其免疫功能[3]。研究表明，淋巴細胞的大量浸潤在某些疾病的發生發展過程中起重要作用，明確其機理對于疾病的防治有重要意義。

淋巴細胞遷移是一個非常復雜的過程，涉及到淋巴細胞與內皮細胞的相互作用。淋巴細胞通過自身受體L-selectin、PSDL-1、MadCAM-1與血管內皮細胞表面配體PNAd、P-selectin、E-selec?tin、MadCAM-1 結合后被內皮細胞捕獲[4-5]，隨后，淋巴細胞通過整合素受體或白細胞功能相關抗原與血管內皮細胞表面的黏附分子ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1 結合，從而啟動鈣離子信號通路，肌動蛋白微絲收縮，血管內皮細胞間的緊密連接破壞，淋巴細胞隨之遷移[5-6]。在趨化因子CCL19、CCL21的趨化作用下，淋巴細胞跨越血管內皮細胞到達各個組織，行使其免疫監視和免疫保護功能。

我們前期篩選出一些在小鼠胰島血管內皮細胞MS1 上高表達的基因，比如毛狀樣蛋白1（co?actosin-like protein-1，Cotl1）基因，這些基因可能影響淋巴細胞的遷移。據報道，Cotl1 對小鼠新皮層神經元的遷移產生一定的影響[7]，Cotl1在小鼠皮質發生過程中抑制神經元遷移[8]，而Cotl1在淋巴細胞遷移中的機制沒有報道。因此，我們在此擬探討炎癥條件下Cotl1 調節淋巴細胞的遷移，該研究對于深入理解淋巴細胞跨內皮細胞向外周淋巴結遷移具有重要的指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠胰島血管內皮細胞MS1、大腸桿菌DH5α、敲除質粒puro_Cas9_empty 由本室保存；引物合成及測序由Invitrogen 公司完成[sgRNA 引物為Cotl1-F（5'-CACCGTCTCTCCGAGGACCTTAGC T-3'）和Cotl1-R（5'-AAACGGTGCCCACCCTCTTT CAAAA-3'），ICAM1、VCAM1、P-selectin RT-PCR引物為本室保存]。DMEM細胞培養基、胎牛血清、青鏈霉素購自Hyclone 公司；LipofectAMINE 2000 轉染試劑、嘌呤霉素購自Invitrogen 公司；BsmBⅠ內切酶、DTT 購自Thermo Scientific 公司；LPS、CCL19 購自Peprotech 公 司；流 式 抗 體購 自eBioscience 公司；RNA 提取試劑盒購自全式金生物技術有限公司；TaqDNA 聚合酶、實時定量PCR SYBR Premix ExTaq、T4DNA 連接酶購自大連寶生物工程有限公司；氨芐青霉素購自Sig?ma 公司；質粒小量提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；基因組提取試劑盒購自北京天為時代生物科技有限公司；Transwell 小室（5 μm）、細胞培養皿及培養板購自Corning 公司；實時熒光定量PCR 儀ABI 7500 購自美國應用生物系統公司；流式細胞儀BD LSRFort?essa 購 自 美國BD 公 司。

1.2 敲除載體的構建

利用在線網站http://crispr.mit.edu 設計sgRNA引物并構建敲除載體，通過核酸電泳及測序進行驗證。

1.3 敲除細胞系的篩選及鑒定

鋪5×104MS1細胞于6 孔板，過夜培養直至細胞密度達到60%左右即可用于轉染。將1～2 μg 敲除質粒用LipofectAMINE 2000 轉染，其中不轉染質粒的孔為空白對照；用終濃度為2.5 μg/mL的嘌呤霉素篩選72 h，直至空白對照細胞全部被殺死；胰酶消化剩余細胞，計數并將30～50個細胞接種至96 孔板，以確保能篩選到單個細胞；單個細胞經1周培養后，剔除有2個細胞以上的孔，轉移至48 孔板擴大培養，然后接著6 孔板培養直至長滿單層細胞；提取基因組并PCR 測序，將正確的敲除細胞系于液氮中保存。

1.4 淋巴細胞與血管內皮細胞黏附實驗

5×104細胞鋪于48 孔板直至長成單細胞層；DMEM 洗2 次，并加終濃度 為10 ng/mL的LPS 刺激過夜；DMEM 洗2 次，取野生小鼠腹股溝和腋窩淋巴結，研磨、計數，按內皮細胞∶淋巴細胞為1∶8的比例進行黏附實驗，時間為24 h；DMEM 洗5次，胰酶消化后流式細胞術分析，根據細胞大小區分內皮細胞和淋巴細胞，并統計淋巴細胞占總細胞的百分比。

1.5 血管內皮細胞表面黏附分子檢測實驗

RT-PCR和流式抗體檢測MS1細胞和敲除細胞Cotl1-/-表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin的表達情況，其中LPS的用量為0、2.5、5和10 ng/mL。LPS 作用24 h后，處理細胞并進行RT-PCR，HPRT 為內參；或染色ICAM1、VCAM1、P-selectin抗體進行流式實驗。

1.6 Transwell 實驗

5 μm Transwell 小室用于淋巴細胞與內皮細胞遷移模型。MS1細胞和敲除細胞Cotl1-/-重懸至4.5×105/mL，取100 μL細胞加到Transwell 小室上層，600 μL DMEM 加到小室下層，培養至單分子細胞層；DMEM 洗2 次，然后在小室上方加入終濃度10 ng/mL的LPS 刺激過夜，小室下方換成新鮮DMEM 培養基；DMEM 洗2 次，取野生小鼠腹股溝和腋窩淋巴結，研磨、計數，按內皮細胞∶淋巴細胞為1∶8的比例進行遷移實驗，即在小室上方加100 μL 5×106/mL 淋巴細胞，下方加600 μL 終濃度為10 ng/mL的趨化因子CCL19，作用24 h，收集淋巴細胞，流式染色并上機分析。

2 結果

2.1 敲除細胞Cotl1-/-的構建及鑒定結果

利用CRISPR/Cas9 敲除小鼠胰島血管內皮細胞MS1的Cotl1基因。圖1 為PCR 電泳圖，挑取23個克隆均為陽性，最后一個為空白質粒。測序結果證明敲除細胞株Cotl1-/-構建成功。

2.2 淋巴細胞與血管內皮細胞黏附結果

淋巴細胞與血管內皮細胞的黏附結果見圖2，在LPS 刺激下，淋巴細胞黏附MS1細胞的比例顯著高于敲除細胞Cotl1-/-。在LPS 刺激下，淋巴細胞與MS1細胞的黏附顯著高于敲除細胞Cotl1-/-，且隨著LPS 濃度升高黏附值越高。該結果證明在炎癥條件下Cotl1基因可以促進淋巴細胞與血管內皮細胞的黏附。

2.3 血管內皮細胞表面黏附分子的表達情況

分別采用RT-PCR和流式方法檢測了MS1細胞和敲除細胞Cotl1-/-在LPS 刺激下黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin的表達情況，結果如圖3。在LPS 刺激下，ICAM1、VCAM1、P-selectin的表達量均顯著升高，且MS1細胞表達的ICAM1、VCAM1、P-selectin 要顯著高于敲除細胞Cotl1-/-，證明在炎癥條件下血管內皮細胞MS1表面的黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 上調表達。

圖1 敲除細胞系Cotl1-/-的菌落PCR 鑒定

2.4 淋巴細胞跨血管內皮細胞的遷移結果

用Transwell 方法比較了在LPS 刺激下淋巴細胞及亞群穿過MS1細胞和敲除細胞Cotl1-/-的差異，結果如圖4。統計結果發現總淋巴細胞穿過MS1細胞的比例顯著高于敲除細胞Cotl1-/-，說明Cotl1基因缺失嚴重影響了淋巴細胞的跨血管內皮細胞遷移。我們同時分析了淋巴細胞不同亞群穿過MS1細胞和敲除細胞Cotl1-/-的遷移情況，發現CD4和CD8 T細胞穿過MS1細胞的比例顯著高于敲除細胞Cotl1-/-，而B細胞無顯著差異，說明CD4和CD8 T細胞的跨血管內皮細胞遷移受到Cotl1基因的影響。

圖2 淋巴細胞與血管內皮細胞黏附結果比較

圖3 內皮細胞表面黏附分子的檢測

圖4 淋巴細胞及其亞群穿過MS1細胞和敲除細胞Cotl1-/-的百分比比較

3 討論

淋巴細胞是機體參與正常免疫應答及炎癥反應的重要功能細胞，而血管內皮細胞是調控淋巴細胞遷入和遷出的重要基質細胞，是通過表達一系列選擇素配體、黏附分子和趨化因子來進行調節的。研究表明，向淋巴結遷入的T細胞高表達L-selectin，而外周淋巴結的高內皮細胞則高表達L-selectin的配體PNAd（peripheral node ad?dressin）。PNAd 是一系列能和L-selectin 結合的硫化、糖基化和唾液酸化的唾液黏蛋白，包括Gly?CAM、CD34、sgp200 等。在腸系膜淋巴結及派爾結內的高內皮細胞上，則高表達L-selectin 另一配體MadCAM-1[9]。P-selectin和E-selectin 也參與T細胞的黏附和遷移，其中E-selectin 可介導記憶性CD4+T細胞與活化的血管內皮細胞的黏附。此外，T細胞表面的CCR7與HEV 介導的趨化因子CCL19 或CCL21 接觸，使LFA-1 發生外翻，隨即與黏附分子ICAM-1、ICAM-2 或VCAM-1 緊密結合，T細胞 被緊 緊 吸附在HEV 上[1]。

淋巴細胞跨血管內皮細胞遷移主要取決于與高內皮細胞微靜脈的相互作用。我們前期通過RNA-seq 方法篩選到一些在小鼠胰島血管內皮細胞MS1 上高表達的基因，如Cotl1基因，但關于Cotl1 是否影響淋巴細胞的遷移目前尚無文獻報道。因此，本研究探討了炎癥條件下Cotl1 調節淋巴細胞的遷移。主要研究方法是通過CRISPR/Cas9 技術在體外構建敲除細胞株Cotl1，然后通過細胞黏附和Transwell 實驗來探究Cotl1基因如何調節淋巴細胞跨血管內皮細胞的分子機制。PCR及測序結果證明敲除細胞株Cotl1-/-構建成功。黏附實驗證明，在LPS 刺激下淋巴細胞對MS1細胞的黏附能力顯著高于敲除細胞Cotl1-/-，說明Cotl1基因能促進淋巴細胞與血管內皮細胞的黏附。那么這種黏附的分子作用機制又是如何？細胞之間的黏附主要是通過表達各種黏附分子起作用的，主要的黏附分子包括ICAM1、VCAM1、P-se?lectin 等，于是我們檢測了MS1細胞和敲除細胞Cotl1-/-表面黏附分子的表達，結果證實，無論在RNA 還是蛋白水平，在LPS 刺激下MS1細胞表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin表達量顯著高于敲除細胞Cotl1-/-，證明黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 參與了血管內皮細胞和淋巴細胞的黏附過程。黏附是遷移的第一步，亦是關鍵一步，但黏附不一定發生遷移，因此，我們用Tran?swell 模型比較了淋巴細胞及其亞群穿過MS1細胞和敲除細胞Cotl1-/-的遷移能力，發現在LPS 刺激下淋巴細胞及其亞群（除B細胞外）穿過MS1細胞的能力略高于敲除細胞Cotl1-/-，證明Cotl1基因可能影響到淋巴細胞的跨血管內皮細胞遷移。

目前我們對于淋巴細胞跨內皮細胞遷移的認識還太少，因此，本研究不僅可以進一步加深對淋巴細胞遷移和免疫應答機制的理解，同時對淋巴細胞應答的免疫調控和臨床應用也具有一定的指導意義。