肺腺癌增強子調控miRNA前饋環路的識別與功能分析

李志學，梁子涵，賈承霖，漆宇騁，岳俊杰，郭志云

1.西南交通大學 生命科學與工程學院，四川 成都610031；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京100071

肺癌在世界范圍的發病率和致死率都高居各類癌癥之首，分別達11.6%和18.4%[1]。肺癌分為小細胞癌和非小細胞癌，非小細胞癌又分為鱗狀細胞癌、腺細胞癌等亞型，其中肺腺癌最為常見。肺腺癌治療方法主要包括手術、放療、化療和靶向治療，但僅靠這些療法還無法保證徹底治愈[2]。因此，關于肺腺癌發生發展分子機制及調控機理的研究，仍是學術界關注的熱點。

在人類進化演變的過程中，形成了紛繁復雜又高度有序的基因網絡調控結構，它們由一定的模序（motif）元件所構成，在生物體內發揮著重要的基因調節作用[3]。其中，前饋環路（feed-for?ward loops，FFLs）是一種重要的循環線性模序，它由2個輸入調節因子P1和P2，以及1個輸出因子P3 構成。P1 可以調節P2，也可以與P2 共同調節P3，即P3 所受到的網絡調節的影響是P1、P2 元件綜合作用的結果。

增強子是真核細胞中普遍存在的順式調控元件，可以通過招募轉錄因子（transcription fac?tor，TF），進而結合多種激活因子，形成多蛋白復合物，使染色質成環，遠端調控啟動子。通過對增強子染色質的修飾和重塑等作用，促進基因的轉錄[4]。此外，較多證據表明，增強子與microRNA（miRNA）間同樣存在復雜的調控關系。Xiao 等[5]通過刪除HEK293T細胞系中的miR-24-1 增強子基因座，發現miR-24-1的表達量下降，其鄰近基因不能再被激活，表明miR-24-1 鄰近基因的轉錄激活依賴于完整增強子的存在。此外，miR-24-1可激活增強子RNA（eRNA）表達，改變組蛋白修飾，增加增強子位點p300和RNA PolⅡ的富集，從而激活轉錄。Suzuki 等證明增強子可以通過募集Drosha和DGCR8 這2個在miRNA初始轉錄本（primary miRNA，pri-miRNA）剪接過程中發揮重要作用的蛋白，調控成熟的miRNA在細胞中的水平，進而影響基因的表達[6]。目前，關于肺腺癌前饋環路的研究，多集中于miRNA-TF-基因所形成的調控網絡，而增強子在該調控網絡中發揮什么樣的作用、如何發揮作用，還不夠清晰。

考慮到前饋環路模型的多樣性和靈活性，我們在此將其引入肺腺癌分子機制的研究，通過數據篩選和處理，期望進一步了解在肺癌腺產生過程中，增強子、轉錄因子、miRNA、基因之間存在的調控關系。綜合多組學數據，本研究構建了TF-增強子-miRNA的前饋環路，并探討該前饋環路的功能，為探究肺腺癌發生的分子機制及其調控機理提供新的思路，也為以網絡標志物為主的肺腺癌診斷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 肺腺癌增強子數據的獲取

增強子數據下載自HACER[7]數據庫。該數據庫通過GRO_seq和PRO_seq 整合FANTOM與其他轉錄非穩定RNA的增強子，是目前最為全面的增強子數據庫。我們從HACER 數據庫下載肺腺癌A549細胞增強子3870個。

1.2 TF-增強子作用關系的識別

從Cistrome DB[8]和Unibind[9]數據庫下載獲取A549細胞系中的97個轉錄因子的Chip-Seq 數據集（.bed 文件），作為轉錄因子與DNA的結合位點信息。當轉錄因子的結合位點包含于同一染色體的增強子區域時，認為該轉錄因子對該增強子具有調控關系。

1.3 增強子-miRNA作用關系的識別

miRNA位置信息下載自miRBase 數據庫[10]，miRNA轉錄起始位點數據下載自FANTOM 數據庫，人類蛋白質編碼基因注釋數據下載自GEN?CODE 數據庫。根據先前的增強子調控miRNA研究[11]，對每個增強子的上游或下游，分別找到距增強子中心最近的miRNA轉錄起始位點和同側的所有蛋白質編碼基因轉錄起始位點。將增強子中心與miRNA轉錄起始位點間的距離定為M，增強子中心與同方向蛋白質編碼基因轉錄起始位點間的距離定為G。以調控評分公式計算score值，設定score值為0～0.2的增強子與miRNA之間存在調控關系。

1.4 TF-miRNA作用關系的識別

利用上述獲取的轉錄因子、miRNA數據，如轉錄因子的結合位點包含于miRNA轉錄起始位點上游10 kb 及下游1 kb，認為該轉錄因子對該miRNA具有調控作用[12]。

1.5 TF-增強子-miRNA前饋環路的合并與多重假設檢驗

將上述3 類調控關系進行組合篩選，采用超幾何檢驗獲取非隨機性的前饋環路。公式如下：

其中，M為miRNA總數，N為某一轉錄因子所調控的miRNA總數，k為某一增強子所調控的miRNA總數，x為該轉錄因子所調控的miRNA與該增強子所調控的miRNA的交集。依據Benjamini-Ho?chberge[13]方法，利用FDR值對該超幾何檢驗的概率值進行修正，并計算q值，將q≤0.05的前饋環路作為有生物學意義的前饋環路。

1.6 在前饋環路中提取關鍵性miRNA

miRNA都能夠對基因表達起調控作用，從構建的TF-增強子-miRNA前饋環路中選擇參與多個前饋環路的miRNA，獲取參與前饋環路的每個miRNA的表達量，將miRNA高于平均miRNA表達的作為前饋環路關鍵性的miRNA。前饋環路關鍵性miRNA表達量下載自FANTOM5 數據庫[14]。

1.7 前饋環路關鍵性miRNA的靶基因識別與富集分析

從mirTarBase[15]數據庫下載經實驗證實的miRNA靶基因，采用R軟件包clusterProfiler 對miRNA靶基因進行Gene Ontology（GO）與KEGG Pathway 功能富集分析。

1.8 前饋環路關鍵性miRNA的靶基因生存分析

利用KMplot[16]生存分析在線工具，選擇TF-增強子-miRNA前饋環路關鍵靶基因進行臨床樣本的生存分析。

2 結果與討論

2.1 轉錄因子、增強子、miRNA作用關系篩選

通過上述數據庫搜索，獲取了97個轉錄因子的DNA 結合位點信息、3870個肺腺癌組織特異性活性增強子區域信息、4801個miRNA的轉錄起始位點信息和80 455個蛋白質編碼基因的轉錄起始位點信息。最終，我們識別了227個TF-增強子作用關系，涉及61個轉錄因子和66個增強子；6973個增強子-miRNA作用關系，涉及3767個 增強子和1262個miRNA；10 715個TF-miRNA作用關系，涉及89個轉錄因子和1367個miRNA。

2.2 肺腺癌前饋環路構建

通過對上述作用關系進行整合，最終共獲得36個肺腺癌TF-增強子-miRNA前饋環路（表1），其中增強子（chr11：355877～356724）參與的前饋環路數目最多，為7個。本研究構建的前饋環路涉及增強子，增強子對miRNA的調控全為正調控，由此構建的前饋環路均為連貫前饋環路[3]。

在這些前饋環路中，平均每個miRNA涉及2.769個轉錄因子，其中大于等于3個轉錄因子的miRNA有hsa-miR-6734、hsa-miR-4677、hsa-miR-6743、hsa-let-7i、hsa-miR-210、hsa-miR-4492、hsa-miR-6760。hsa-miR-210 已被證實與肺癌相關[17]。這些miRNA在肺癌發生發展的過程中可能起關鍵作用，例如調控肺癌相關基因的表達，提高肺癌細胞的轉移性、浸潤性或異質性等。

2.3 肺腺癌前饋環路關鍵miRNA的GO與KEGG功能富集分析

從mirTarBase 數據庫獲取了36個TF-增強子-miRNA前饋環路中miRNA的所有靶基因，共計2404個，利用R 軟件包clusterProfiler 對所有靶基因進行了GO 功能富集。我們發現肺腺癌前饋環路在細胞周期正調控、細胞分化、蛋白質穩定性調控、能量代謝和糖代謝等方面具有重要功能（圖1），這與文獻報道的癌細胞基因功能一致。通過功能富集分析，我們發現了在肺癌細胞中起關鍵作用的多效基因TP53、IGF1、TPR、CREB、CASP3、STAT5B、APP、USP19 等，其中TP53、IGF1、TPR、CREB、CASP3、STAT5B、APP、USP19 已被證實與腫瘤密切相關，如TP53[18]和CREB基因已被證實可顯著影響肺腺癌的增殖。Illiano 等采用脂聯素干預A549 肺腺癌細胞，發現脂聯素可抑制CREB基因表達，顯著降低肺腺癌細胞的增殖[19]。

圖1 肺腺癌全前饋環路靶基因GO 功能富集結果

對靶基因進行KEGG 通路富集分析（圖2），發現與肺腺癌前饋環路miRNA靶基因廣泛參與糖代謝、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、半胱氨酸/甲硫氨酸代謝等通路。該結果說明肺腺癌前饋環路在大分子化合物代謝通路中起關鍵作用，該結果與癌細胞生理特征一致，其中涉及的關鍵基因有PGAM1、PGAM4、LDH4、LDHB、AGXT2 等。

為探究上述肺腺癌TF-增強子-miRNA前饋環路關鍵靶基因對肺腺癌患者的影響，我們對其中參與富集功能（≥2個）的多效基因進行生存分析。選擇具有表達活性差異的基因發現，TP53和CREB1在高表達時會使肺腺癌患者的生存率降低，而STAT5B和TPR在低表達時會使肺腺癌患者的生存率降低（圖3）。因此與多效基因TP53、CREB1、STAT5B、TPR 有關的前饋環路可能對肺腺癌的發展、轉移有重要影響。

2.4 肺腺癌前饋環路關鍵miRNA表達特征

依據FAMTOM5 提供的miRNA表達量數據，發現上述6個miRNA中，hsa-let-7i-3p、hsa-miR-210-5p、hsa-miR-6734-5p與hsa-miR-4677-5p在體內的表達量顯著高于前饋環路涉及到的13個miRNA表達量的平均值，暗示這4個miRNA可能是肺腺癌的關鍵性miRNA。其中hsa-miR-6734參與了7個前饋環路，顯著高于表達量平均值2.769，共涉及7個重要的轉錄因子ETS1、GABPA、PBX3、TEAD4、YY1、ZBTB33、DNase。其中的YY1已有文獻報道與腫瘤發生有關[20]。

表1 36個肺腺癌TF-增強子-miRNA前饋環路

圖2 肺腺癌全前饋環路靶基因KEGG 通路富集結果

2.5 4個關鍵miRNA靶基因功能分析

圖3 多效基因TP53（A）、CREB1（B）、

分別對上述4個關鍵miRNA靶基因進行GO功能分析和KEGG 通路分析。一方面我們獲取了這4個關鍵miRNA的功 能活性，hsa-miR-6734 具有強的核酸轉錄抑制活性，hsa-miR-210 具有強的分解代謝活性，hsa-let-7i 具有強的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，而hsa-miR-4677 無明確的富集功能。另一方面，構建4個關鍵miRNA的基因調控網絡，發現hsa-miR-210 調控細胞分解代謝和應激反應功能的關鍵靶基因PLK1、APC、BNIP3、ATG7、SIN3A，hsa-miR-6734 調 控 各 類 復 合 物（NuRD、CHD 類等）功能的關鍵靶基因MTA1、CSNK2A1、RBBP4、ZBTB7A，hsa-let-7i細胞周期正調節功能的關鍵靶基因IGF1、PDGFB、CDKN1A、CCND1、EDN1和CCNT2。

2.6 結論

我們探討了TF-增強子、增強子-miRNA、TFmiRNA作用關系，并識別了肺腺癌細胞系相關的36 條TF-增強子-miRNA前饋環路，涉及22個轉錄因子、13個增強子、13個miRNA。在功能富集和通路富集方面，我們發現肺腺癌細胞TF-增強子-miRNA前饋環路靶基因顯著富集于與癌癥密切相關的生物功能上，如細胞周期正調控、細胞分化、蛋白質穩定性調控、能量代謝和糖代謝等，其中涉及的關鍵基因已被很多研究證實在癌癥細胞中特異表達。KEGG 通路富集結果顯示前饋環路靶基因富集于肺癌代謝相關信號通路。結合miRNA的參與環路數和表達量，我們篩選了前饋環路關鍵miRNAhsa-miR-6734、hsa-miR-210、hsa-miR-4677和hsa-let-7i，探討了它們與基因的調控關系網絡。另外，我們對參與富集功能多的多效基因進行肺腺癌生存分析，發現前饋環路的多效靶基因TP53、CREB1、STAT5B、TPR的表達差異對患者肺癌的生存發展有重要影響。本研究揭示了肺腺癌相關前饋環路的特點，為以后肺腺癌前饋環路研究提供理論與方法參考。