糖尿病腎病足細胞損傷機制的研究進展

王 娜，鄒大威

(1.首都醫科大學，北京100069； 2.首都醫科大學中醫藥學院，北京100069)

糖尿病腎病是糖尿病的慢性微血管并發癥之一。在我國，30%～50%的糖尿病患者合并有腎病[1]。早期糖尿病腎病的特征是微量白蛋白尿,并逐步進展至大量白蛋白尿，以及血清肌酐和尿素氮水平升高，最終進展為腎衰竭。患者一旦發生腎衰竭則需要行透析或腎移植治療。臨床上，有效的干預措施能防止或延緩糖尿病腎病的進展，因此研究糖尿病腎病的發病機制是極為必要的。研究表明，腎小球濾過屏障的組分之一——足細胞數量減少、結構或功能完整性破壞與蛋白尿的產生存在相關性[2]。因此，研究足細胞的損傷機制可能為糖尿病腎病的干預治療提供新思路。現就糖尿病腎病中足細胞損傷的機制進行綜述。

1 氧化應激

早在2001年，Brownlee[3]就提出氧化應激是糖尿病及其并發癥的共同病機。在高糖刺激下，細胞會生成大量晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)，并在細胞內部不斷聚積。在AGEs產生過程中，線粒體還會釋放大量的活性氧類(reactive oxygen species,ROS)，過量的ROS打破機體氧化體系與抗氧化體系的平衡，損傷細胞。氧化應激可直接導致足細胞凋亡，或通過重排肌動蛋白、增加內皮素-1合成、改變微血管通透性最終導致足細胞損傷。

1.1氧化應激直接導致足細胞凋亡 細胞色素C從線粒體轉移至細胞質是細胞凋亡的關鍵步驟[4]。ROS可通過氧化心磷脂，降低心磷脂對細胞色素C的親和力，促進細胞色素C與線粒體內膜分離，并釋放至細胞質。細胞色素C進入細胞質后與細胞質中的凋亡激活因子-1結合，促進凋亡激活因子-1寡聚化。凋亡激活因子-1可募集caspase-9并形成凋亡小體，最終導致足細胞凋亡。抑制線粒體氧化損傷和細胞色素C釋放，消除線粒體ROS，可阻止細胞凋亡途徑的激活和足細胞損傷[5]。慢性腎病常伴有高脂血癥，ROS過量生成與脂質代謝紊亂共同參與了糖尿病腎病腎功能損害的進程[6]。棕櫚酸可促進線粒體產生ROS，過量的ROS通過線粒體凋亡途徑參與氧化應激導致的凋亡。若用線粒體抗氧化劑預處理足細胞，而后再加入棕櫚酸，線粒體積累的ROS以及足細胞凋亡顯著降低[7]。

1.2氧化應激間接導致足細胞損傷 ROS是足細胞中肌動蛋白絲分布和凋亡的重要介質[8]。肌動蛋白絲是細胞骨架的主要成分，用于維持足細胞足突的完整性。ROS水平升高誘導足細胞肌動蛋白重排，足突融合，最終導致腎小球濾過屏障功能障礙，這可能是脂質過氧化過程中形成的脂質自由基導致的[9]。纖溶酶原誘導的線粒體ROS可通過促進足細胞合成內皮素-1，誘導足細胞損傷。使用線粒體ROS選擇性抑制劑可阻止纖溶酶原對內皮素-1合成的促進作用[10]。當氧化應激導致線粒體產生的ROS增加時，自由基會誘發DNA鏈斷裂，從而激活核中的DNA修復酶，導致3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性受到抑制，AGEs受體表達增加，最終導致細胞損傷[11]。AGEs可通過提高血管內皮生長因子的表達而導致蛋白尿。在體外足細胞實驗中，高糖條件下血管緊張素Ⅱ的表達增加，血管緊張素Ⅱ通過作用于血管緊張素Ⅱ受體，刺激內皮生長因子表達[12]。AGEs可導致血管緊張素Ⅱ受體表達上調[13]，使細胞能夠更好響應血管緊張素Ⅱ的刺激，提高內皮生長因子的表達量。一氧化氮合酶缺陷會導致氧化應激水平升高[14]。可能的機制是一氧化氮合酶缺陷導致具有舒張血管效應的NO合成不足，使得血管不能有效對抗血管緊張素Ⅱ的作用，導致內皮生長因子途徑中的負調節活性喪失，氧化應激水平升高。

2 微RNA

微RNA(microRNA,miRNA)是一類在細胞內普遍存在的內源性非編碼小分子RNA，長度為21～24 bp，可通過阻滯蛋白質翻譯或誘導信使RNA裂解等發揮轉錄后調控基因表達的作用。miRNA并非通過單一途徑影響特定靶基因，而是可以改變大量靶基因的表達，影響疾病進程。與糖尿病腎病足細胞損傷相關的miRNA可分為兩類，一部分miRNA的表達量隨糖尿病腎病的發展而下降，提示這部分miRNA的高表達具有腎臟保護作用；而另一部分miRNA在高糖條件下表達上調，加重腎臟損害，提示其高表達具有損傷腎臟的作用。高糖條件下表達下調導致足細胞損傷的miRNA主要包括miR-125、miR-30、miR-346、miR-34c，表達上調加重腎損害的miRNA包括miR-195、miR-21、miR-155、miR-27a。

2.1miRNA表達下調導致足細胞損傷 在高糖誘導的足細胞損傷模型中，miR-125表達下調可導致細胞凋亡，其機制與負性調控p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)及p38MAPK磷酸化蛋白表達,進而激活SIRT1-P53通路有關；同時，高表達miR-125能有效抑制高糖誘導的足細胞凋亡，其機制與阻斷SIRT1-P53通路有關[15]。以上研究證實了miR-125在糖尿病足細胞損傷中的調控作用。

miR-30家族對足細胞的結構和功能穩態至關重要，其表達量的下調會導致足細胞損傷。高糖條件下，miR-30d啟動子因受轉化生長因子-β (transforming growth factor β，TGF-β)的負性調控，導致miR-30家族的表達顯著下調[16]。高表達miR-30a的人足細胞可抵抗損傷因素的刺激[17]，其是通過抑制足細胞上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)實現的[18]。

在高糖條件下,同樣能夠抑制EMT的miR-346的表達量也明顯降低。miR-346對EMT的抑制作用是通過抑制糖原合成酶激酶-3的合成實現的[19]。足細胞發生EMT后會獲得活動性，從腎小球基底膜脫落，加重蛋白尿。使用高糖刺激足細胞會導致miR-34c的表達量顯著降低，過表達的miR-34c可顯著降低Notch1和Jagged1的信使RNA水平，從而抑制足細胞凋亡[20]。

2.2miRNA表達上調導致足細胞損傷 高糖條件下培養的足細胞中miR-195的表達上調，miR-195通過級聯反應下調凋亡抑制基因Bcl-2的表達[21]，最終導致足細胞凋亡。miRNA-陣列分析顯示，與健康對照組相比，2型糖尿病模型小鼠血漿miR-21的水平明顯升高[22]，且miR-21的水平與2型糖尿病小鼠的蛋白尿程度相關[23]。miR-21在足細胞中的過表達可促使足細胞去分化，并增加足細胞的遷移；抑制miR-21的表達可減少足細胞遷移。miR-21是通過激活Wnt/β-catenin通路中的關鍵因子β-catenin，上調TGF-β1/Smads通路中TGF-β1和P-Smad3的水平，并降低Smad7的水平，促進足細胞的去分化，使足細胞發生EMT[24]。miR-21增加足細胞的遷移能力則是通過影響張力蛋白同源物實現的[23]。

Nephrin是一種上皮標志物，同時也是足細胞的骨架結構蛋白，參與腎小球足細胞中細胞-細胞黏附，并且是信號轉導的細胞表面受體，其崩解會導致蛋白尿[25]。與對照組相比，由鏈脲佐菌素誘導的糖尿病野生型C57小鼠中miR-155的表達顯著增加，而足細胞nephrin和乙酰化nephrin的水平則降低[26]；而采用鏈脲佐菌素誘導的糖尿病miR-155-/-小鼠與野生型相比，尿蛋白排泄顯著降低，足細胞損傷標志物desmin的表達也顯著降低，而nephrin、乙酰化nephrin以及WT-1的水平則升高[26]。該研究證實，miR-155表達的升高使nephrin以及乙酰化nephrin的水平降低，導致糖尿病腎病的腎損傷。miR-27a表達的上調會導致內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和足細胞損傷，其是通過負向調控叉頭框蛋白O1的表達，并激活ERS實現的。使用miR-27a抑制劑可發現高糖培養條件下的足細胞中叉頭框蛋白O1的表達上調，ERS相關分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和葡萄糖調節蛋白78的表達下調，氧化應激減弱[27]。

3 自 噬

自噬現象存在于正常狀態人的足細胞中，且一定水平的自噬對維持人足細胞的結構、功能以及代謝穩態有重要作用[28]。自噬異常會導致糖尿病腎病蛋白尿進展[29-30]。多種信號轉導通路參與足細胞自噬的調節，目前研究主要集中在哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、沉默信息調節因子-1(sirtuin 1，SIRT1)3個信號通路。

3.1mTOR通路 細胞自噬與凋亡是一個動態平衡的過程，其中mTOR通路是兩者共同的中樞。與營養相關的細胞自噬在足細胞損傷中發揮了重要作用。mTOR是自噬的負性調控因子[31]。AGEs能促使人足細胞中mTOR的活化，抑制轉錄因子EB的核轉位，下調自噬相關基因的表達，從而抑制足細胞中自噬體的形成，同時增加足細胞的早期凋亡和晚期凋亡[32]。高遷移率族蛋白-1可通過抑制Akt/mTOR通路，減少足細胞自噬[33]。Pim1-p21-mTOR信號軸對足細胞自噬也有影響。Pim1參與調節自噬相關蛋白(autophagy-related protein，Atg)p21的降解[34]。Pim1抑制劑可調控mTOR的表達,激活足細胞的自噬[35]。足細胞的保護性自噬減少，足細胞凋亡增加，這可能是導致糖尿病腎病腎臟損傷的原因之一。氨基酸信號是自噬調節的重要上游信號。氨基酸饑餓增加了自噬體數量，抑制了mTOR的活性，增加了轉錄因子EB的活性，而抑制轉錄因子EB可阻斷氨基酸饑餓誘導的自噬[36]。以上研究表明，氨基酸饑餓可通過抑制mTOR通路和活化轉錄因子EB介導足細胞自噬。

3.2AMPK通路 AMPK作為代謝傳感器發揮作用，協調細胞在各種器官(包括腎臟)中的存活和功能。AMPK可以磷酸化TSC2絲氨酸殘基1 387位點，激活其復合物的GAP活性，從而使哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)失活。 mTORC1可通過Ser 317和Ser 777位點的磷酸化直接激活UNC-51樣激酶1，并加強UNC-51樣激酶1與AMPK的相互作用，最終引發自噬[37]。SIRT1是可以調節代謝和細胞存活的脫乙酰酶。AMPK可通過AMP/ATP的變化感知細胞的能量變化，當比值升高時，即胞內能量處于低水平時，AMPK激活。AMPK活化后可直接激活Atg1，也可通過抑制mTOR的活性調節自噬。高糖環境下培養的足細胞中AMPK的表達減少，而應用AMPK激動劑能改善高糖對腎臟的損傷[38]，提示糖尿病環境下足細胞AMPK失活，而激活AMPK能改善AMPK對自噬的調節。在營養缺乏等應激狀態下，機體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸比例升高提示能量不足，Sirt1被激活[39]，Sirt1能通過促進自噬體的形成，促進足細胞自噬[40]。

3.3SIRT1通路 SIRT1通過去乙酰化Atg，如Atg5、Atg7、Atg8以及叉頭蛋白轉錄因子3a，在細胞中發揮效應[41]。在Sirt1敲除小鼠中可發現足細胞自噬受到抑制[42],證明Sirt1起到正向調控自噬和抗細胞凋亡的作用。

3.4其他 長鏈非編碼RNA也可通過調控足細胞自噬參與疾病進程。長鏈非編碼RNA表達的失調參與了多種人類疾病的發生和發展，但目前對于長鏈非編碼RNA在糖尿病腎病進程中的作用尚不明確。有研究發現，長鏈非編碼RNA可通過調節足細胞自噬參與疾病進程[43]。Gm5524在響應糖尿病腎病時顯著上調，而Gm15645則在響應糖尿病腎病時顯著下調。在高糖培養條件下，Gm5524的敲低和Gm15645的過表達降低了足細胞的自噬，并誘導小鼠足細胞凋亡[44]。長鏈非編碼RNA對足細胞自噬的影響還可通過調節ERS實現。實驗證實，長鏈非編碼RNA TUG1可通過ERS-CHOP-過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α通路實現足細胞自噬的調控[45]。用高糖處理后，足細胞內TUG1的含量明顯升高，而過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α和裂解的caspase-3的含量降低，CHOP的表達升高，足細胞ERS的水平提高，細胞凋亡減少[45]。

除上述機制外，醛固酮/鹽皮質激素受體也可誘導足細胞自噬[46]。此種自噬的調控方式還受ERS和氧化應激的影響。ERS增加了自噬的形成，可保護足細胞免于凋亡。氧化應激則是先通過激活ERS，然后觸發CHOP依賴性細胞凋亡和自噬。血紅素加氧酶-1也可激活足細胞的自噬途徑[47]。雖然此方向研究較少，但也為糖尿病腎病的治療提供了一個新思路。

4 外泌體

高糖可誘導腎小球內皮細胞EMT，經EMT的細胞可通過釋放含有TGF-β1的外泌體刺激足細胞的EMT，并導致足細胞的損傷和功能障礙。腎小球內皮細胞產生的外泌體可被足細胞內化。采用經過EMT的腎小球內皮細胞分泌的外泌體處理足細胞，足細胞的上皮標志物喪失，并獲得間充質標志物，這證明足細胞發生了EMT[48]。進一步研究發現，經外泌體處理的足細胞，足細胞EMT的強誘導劑TGF-β1信使RNA的表達水平升高，并激活了Wnt/β-catenin信號通路，最終誘導了足細胞的去分化，導致細胞骨架解體，足突消失[48]。

5 展 望

糖尿病腎病足細胞損傷機制主要是劃分為氧化應激、自噬、miRNA三大部分，當前研究比較熱門的是自噬、miRNA。近年來，有許多與足細胞損傷密切相關的起到調控作用的miRNA相繼被發現，這為進一步闡明足細胞的損傷機制奠定了基礎。除了上述研究方向外，國內也有團隊創新性地將外泌體納入了損傷機制的研究范圍，并取得了進展；關于長鏈非編碼RNA對足細胞損傷的影響亦是一個新興研究方向。

糖尿病腎病的作用機制是多重且復雜的，就目前對足細胞損傷機制的研究結果很難說明是哪一種因素在導致糖尿病腎病的發生以及發展中起決定性作用，將來或許需要轉變思路，打破固有的從單方面研究足細胞損傷機制的思維方式，從整體層面去研究其機制，這可能有助于更深刻地理解糖尿病腎病中足細胞的損傷機制。在已有的研究中，關于氧化應激、外泌體、miRNA、長鏈非編碼RNA以及自噬相互作用的研究較少，或可作為未來研究的方向。