基質硬度與肝細胞肝癌的相關研究進展

湯思哲，王 仆，孔大陸

(天津醫科大學腫瘤醫院結直腸腫瘤科 國家腫瘤臨床醫學研究中心 天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津 300060)

肝細胞肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，占惡性腫瘤死亡率第二位[1]。雖然其治療手段取得了很大進展，但復發率、轉移率仍未下降，主要表現為肝內轉移率和術后復發率高。因此，尋求新的治療途徑是提高肝細胞肝癌治療效果的關鍵。人體組織中的細胞可能經歷許多機械刺激，如來自血流的剪切應力或來自與肌肉活動相關的幾種組織的拉伸和壓縮力[2]。細胞被細胞外基質包圍，而細胞外基質由許多不同的蛋白質組成，包括層粘連蛋白、膠原蛋白和纖連蛋白。通過施加牽引力，細胞能感測到細胞外基質固有的機械特性，如硬度。細胞對外力反應的能力，包括探測和解讀細胞外基質的機械特性及合成和重構細胞外基質，在許多方面發揮重要作用[3]。如細胞外基質硬度在疾病狀態(如癌癥和纖維化)[4]或衰老[5]下會對細胞的遷移、分化和增殖產生不利影響。另一方面，細胞內異常的信號通路會影響細胞感知和響應外部機械刺激的能力，是造成癌癥、纖維化發展的重要原因，同時也是導致包括癌癥在內疾病的始動因素。細胞感知和響應外部機械刺激的能力被稱為機械力轉導。機械力轉導需要感知外力或生物力學特性并將該信息向后轉導，觸發特定的細胞內信號響應。而細胞骨架可將不同的細胞區域(高爾基體和細胞核)連接到力感知裝置，因此細胞骨架在機械轉導中起關鍵作用[6]。現就基質硬度與肝細胞肝癌的相關研究進展予以綜述，以為臨床肝細胞肝癌的預防和治療提供參考。

1 機械力轉導

自機械生物學概念出現以來，機械信號已被證明幾乎影響了生物學的每個過程[7]。體育鍛煉、呼吸或心臟泵血等大體機械信號在一個多世紀以前就被認為會調節組織發育，而微觀機械信號(如細胞產生的力或血流)對細胞黏附的影響于1980年后才得到證實[8]。隨著觀察和干預體外機械信號技術的出現，細胞如何感知、傳遞和調節機械信號機制逐漸被揭示[9]。

在細胞質中，細胞骨架由肌動蛋白、中間細絲和微管組成，其高動態支架結構是機械信號產生和調節的關鍵單元。這些結構成分的不斷聚合/解聚，以及肌球蛋白Ⅱ誘導的肌動蛋白絲運動，是產生活性力的原因。機械力可傳導至不同的通路：①通過核骨架和細胞骨架復合體直接施加在細胞核上[10]；②在膜和黏著斑上，通過整合素受體將它們傳遞穿過細胞膜并與細胞外基質相互作用[9]；③通過黏附連接，其中鈣黏素受體可將這些力傳遞給鄰近的細胞[11]。沿著上述力作用的軸線，機械信號通過直接的細胞-胞接觸或通過細胞外基質變形傳播。由于細胞骨架的相互連接結構，機械力通過局部粘連或黏附連接，故會引發幾乎每個細胞器變形。細胞將這種來回形式的機械信號(力)轉變為細胞內的生化信號，調整細胞的行為和(或)表型[12]。因此，機械信號可理解為信息處理過程，即由細胞外基質單元“寫入”，通過“傳輸”并由其他單元“讀取”的過程。與其他信息處理系統一樣，信號轉導通路的穩定性和可重復性對細胞的穩定性至關重要。機械力轉導過程配備了許多正反饋回路，以完成高度復雜、精密和動態的水平分子反饋調節，故在細胞的生理及病理過程中發揮關鍵作用。

2 基質硬度與機械力轉導

細胞內在的基因組改變和其對外在可溶性生長因子、細胞因子和趨化因子刺激的反應可產生細胞轉化和腫瘤轉移。腫瘤的發生和演進可概括為包含多個中間步驟的由良性表型至獲得侵犯或轉移特性的過程，包括特定基因的擴增或失活、腫瘤標志物的表達及細胞和組織結構的改變等。同時，這些步驟還應包括細胞和組織的力學表型。不僅包括細胞和組織結構及力學的內在變化，還包括細胞微環境的生物物理學特性改變，如細胞外基質的力學、幾何學和拓撲學[13]。

組織硬度可影響許多生物學過程。人們觸到腫瘤是因為腫瘤本身硬度增加[14]。而研究表明，微環境中的力學變化可促進腫瘤演進[15]。纖維性肺疾病起初為輕度組織硬度的變化，其被細胞感知后可產生更加嚴重、不可復的重構[16]。且細胞外環境的硬度可調控間充質干細胞的分化和造血干細胞的自我更新[17-18]。開發力學特性上可調節的支架以控制細胞行為已成為組織工程的主要任務[19]。

在腫瘤學方面，研究主要集中于細胞外基質的硬度變異如何影響組織細胞的行為。體外3D基質的生物力學特性，特別是其壓力和張力，可對細胞行為產生重要影響，且可能對調控細胞和組織的行為與生物化學因素具有協同作用[20]。乳腺上皮細胞可在重構的基膜基質(Matrigel)中形成具有極性的乳腺腺泡，并可復制在體環境催乳激素刺激下發生的分化[21]。轉化事件可激活細胞侵犯腺泡腔，故整個系統可作為模擬腫瘤發生的模型[20]。研究表明，在不改變其生物化學組成的前提下，增加基膜基質密度可發生乳腺上皮細胞轉化[18]。其通過調節整合素和Rho激酶介導的信號通路發揮作用。這些力學改變可增加細胞生長、細胞極性消失、黏著斑增加、黏著斑激酶、vinculin和p130CAS激活，并導致細胞-細胞連接破壞從而阻止腺泡腔形成[22]。

以上研究表明，組織硬度與細胞表型關系密切，機制涉及機械力轉導。機械力轉導是指將物理信號轉化為細胞內生物化學反應，其主要集中在已確定對力學敏感的分子，如離子通道、整合素、鈣黏素、生長因子受體、細胞骨架、細胞核、胞外基質以及其他大量被認為在機械力轉導反應之中發揮作用的信號分子。在物理因素的刺激作用下，上皮細胞表面的整合素是外力傳向細胞骨架的通道，細胞通過其表面的整合素受體即時響應機械力以張力整合的形式將響應的力信號有選擇地轉換到細胞和核內的不同結構部件上，如黏著斑中的信號分子、細胞骨架結構、細胞膜上的表皮生長因子受體、離子通道、核膜孔、染色體，甚至可能是單個基因，實現力化學轉化，從而調節細胞的增殖、凋亡、黏附、遷移等生理功能，并引起胞形態學上的進一步變化，如極化、突起，最終導致細胞極性改變，這對維持細胞的鋪展和生長，影響細胞的功能產生調控作用[23]。

3 基質硬度、肝硬化與肝細胞肝癌的關系

肝細胞肝癌發生和演進是多因素、多基因和多階段、多途徑的復雜過程，其確切分子生物學機制尚不清楚。相關遺傳學異常主要包括染色體的缺失和重排、異倍體、基因突變及乙型肝炎病毒DNA整合，而表觀遺傳學改變主要為DNA的異常甲基化、組蛋白修飾和染色質重構等[24]。目前肝癌細胞中發現超過20種基因表達異常，且幾乎所有肝癌細胞均發生多種基因和遺傳位點的結構性改變，而每種特定遺傳學或位點改變的影響不超過其中的半數[25]。這可能由于同時存在幾種不同的致癌機制造成，而不同的致癌機制在不同危險因素下發揮作用。

發生肝細胞肝癌的主要危險因素包括病毒(乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、中毒(酒精和黃曲霉素)、代謝性疾病(糖尿病、血色素沉著癥、非酒精性脂肪性肝病)和免疫相關(自身免疫性肝炎和原發性膽管硬化癥)。而其中大多數危險因素可導致肝硬化的形成和演化。80%～90%的肝細胞肝癌患者合并肝硬化，肝硬化患者的5年累積肝細胞肝癌發生率為5%～30%[26]。在一些發達國家肝硬化相關的肝細胞肝癌病死率上升，而肝硬化非肝細胞肝癌并發癥的死亡率在不斷下降或穩定。隊列研究表明，肝細胞肝癌是失代償肝硬化肝臟相關死亡的主要病因[26]。

有研究表明，肝臟硬度與乙型和丙型病毒肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化和肝細胞癌的肝纖維化程度有關[27]。2003年Sandrin等[28]首次引入基于超聲的瞬時彈性成像技術，目前其在臨床廣泛應用于測量肝臟硬度。它以非侵入性方式對肝纖維化和肝硬化顯示出良好的診斷性能。瞬時彈性成像技術對多期肝纖維化肝臟硬度的測量范圍為12.5～75.5 kPa，其中F2期的截尾值為7.1 kPa，F3期和F4期的截尾止值分別為9.5 kPa、12.5 kPa(根據METAVIR評分系統)[29]。而應用原子力顯微鏡測量局部肝臟組織的硬度。在生理條件下，正常肝組織的硬度約為150 Pa，在纖維化肝中纖維膠原沉積的區域硬度增加到1～6 kPa[30]。

對于肝臟硬度產生的原因至今尚不清楚。通過用EVG(Elastica van Gieson)染色彈性蛋白顯示，肝內彈性蛋白區域與肝臟硬度呈正相關，提示彈性蛋白含量可能與肝臟硬度有關[31]。此外，細胞外基質交聯也可增加組織硬度，特別是賴氨酰氧化酶和轉谷氨酰胺酶是細胞外基質交聯過程中起重要作用的兩大類酶。

肝臟硬度的增加使得肝細胞感受到更多的細胞外來力，并通過細胞表面的黏附因子將胞外信號向胞內傳導。Schrader等[32]在經“基質”包被的不同硬度的聚丙烯酰胺凝膠上觀察Huh7和HepG2肝細胞癌細胞發現，提高基質硬度可促進肝癌細胞增殖，并證實其通過β1整合素和黏著斑激酶發揮作用。Lozoya等[33]用6種不同的水凝膠配方培養人肝臟干細胞，然后使用各種標志物分析分化程度。結果顯示，這些細胞具有硬度依賴行為，表明在理想的機械環境中播種的細胞能夠以干細胞生態位中觀察到的相同方式進行自我組織。Yes相關蛋白(yes-associated protein,YAP)和PDZ結合域轉錄共激活因子(transcroptional coactivator with a PDZ-binding domain，TAZ)是激活機械敏感通路之一。經Dupont等[34]鑒定，轉錄輔助因子YAP和TAZ 可作為內皮細胞和間充質基質細胞中的強大機械傳感器，根據基質硬度YAP和TAZ從細胞質轉移到細胞核。除機械傳感之外，它們還可作為細胞-細胞黏附、細胞-基質黏附和細胞骨架信號轉導下游細胞信號轉導的中心節點[35]。YAP和TAZ由激酶大腫瘤抑制基因(large tumor suppressor gene，LATS)1和LATS2直接調節，YAP/TAZ磷酸化導致細胞質螯合或降解。但調節YAP/TAZ核穿梭的精確機械傳感機制仍在研究中。YAP和TAZ本身缺乏DNA結合結構域，其主要通過TEA結構域因子TEAD1～4，以及通過與幾個直接參與纖維化的轉錄因子家族(SMADs和β聯蛋白)的相互作用介導轉錄效應[36]。在上皮細胞中，YAP和TAZ介導細胞存活信號轉導，賦予干細胞分化并參與修復過程，促進間充質轉化，并在腫瘤發生中發揮作用。近年針對肺、肝、腎以及真皮的成纖維細胞研究發現，YAP和TAZ在激活這些細胞向促纖維化轉化中起保守和關鍵作用[37-42]。以上研究表明YAP和TAZ在纖維化級聯中的核心作用。由于YAP和TAZ在許多器官和組織環境中廣泛表達和具有重要生理作用，所以這對該途徑的阻斷性靶向治療的合理性及安全性提出挑戰。此外，Rho/Rho激酶信號可能是機械和受體介導的YAP和TAZ激活的關鍵上游調節因子[43]。ROCK抑制劑在臨床前纖維化模型中的陽性結果表明，YAP/TAZ激活至少部分受到了抑制[44]。而對YAP /TAZ遺傳和分子靶標進行的選擇性抑制劑的探索將提供新的治療途徑，進一步阻斷纖維細胞活化的機械受體轉導途徑。其中，YAP和TAZ抑制靶點的選擇是實現治療價值至關重要的步驟。

4 小 結

機械力轉導包括硬度反應途徑在調節基本細胞功能中起重要作用。機械力的重要功能之一是重構細胞形態。細胞反復感知周圍微環境的變化，通過許多機械力敏感過程聯合細胞狀態實現細胞的極性分化。事實上，形態是由微環境決定的，是通過激素、內部時鐘和受體酪氨酸激酶的響應來實現。而實驗性條件(基質的構成和硬度)的可控性及可操作性，為今后的研究奠定了重要基礎。最近定義的剛性(硬度)傳感過程，為深入研究細胞如何反復感知其微環境變化與癌細胞轉化提供了良好示例。另一方面，CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術進步也促進了在體方法的發展。條件性敲除和在各種模式生物體中引用突變體能快速了解細胞-細胞外基質機械性質變化的相關性及在健康和疾病中的感知方式。 到目前為止，學者已在果蠅模式生物體中發現了很大一部分機械力轉導中的相關性[45-46]。雖然簡單的模式生物在揭示體內相關性方面非常有用，但CRISPR技術的進步可促進哺乳動物的體內研究。目前只有少數研究開始闡明這些機械力轉導事件，但隨著遺傳和生物物理工具的不斷成熟，其將為如何將機械力轉導途徑整合到生理和病理生理細胞和組織過程提供新方向。