Klotho抑制腎間質纖維化的作用及機制

繆靜龍，劉其鋒

(江蘇大學附屬昆山醫院腎臟內科，江蘇 昆山215300)

Klotho是1997年發現的一個新基因，Klotho基因表達缺失的小鼠表現出類似人類衰老的癥狀及體征，因而是一種抗衰老基因[1]。Klotho基因位于第13號染色體(13q12)上，根據其基因結構的不同，可表達膜型及可溶性兩種Klotho蛋白；膜型Klotho是定位于細胞膜的單鏈跨膜蛋白，由全部Klotho基因編碼生成，但其胞外區可以被水解脫落生成可溶性Klotho，可溶性Klotho也可來源于Klotho信使RNA的可變修飾生成[2]。膜型Klotho和可溶性Klotho的表達密切相關，膜型Klotho的減少會導致可溶性Klotho的同步減少；兩者功能類似，但又有所區別：膜型Klotho主要作為成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)23的協同受體，與FGF-23形成復合物后參與機體鈣磷代謝的調節；而可溶性Klotho可以隨血液、體液等全身播撒，作用于相應的靶器官發揮一定的生物學等作用[3-4]。隨著對Klotho生物學認識的不斷深入，發現其功能早已超越了“抗衰老”的范疇(如抗氧化、抗炎、調節鈣磷代謝、抑制血管鈣化、抑制細胞凋亡及組織器官纖維化等)，而Klotho對纖維化的抑制作用尤其值得關注[5]。研究證實，Klotho主要表達于腎臟，Klotho的表達異常也與慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)相關的腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)發生發展相關，被認為是腎臟纖維化的標志物之一[6]。現就Klotho抑制RIF的作用及機制進行綜述。

1 Klotho抑制RIF的作用及機制

Klotho的腎臟保護效應是多因素的，其中對RIF的抑制是Klotho發揮腎臟保護作用的一個重要方面[7]。RIF是CKD最主要的病理特征，也是多種腎臟疾病進展至終末期腎病的最終通路。RIF與腎功能密切相關，抑制RIF也是CKD防治的重要干預靶點。有研究表明，腎組織Klotho表達量與RIF及腎小球硬化程度負相關，而給予外源性可溶性Klotho可減輕RIF程度，改善腎功能，證實了Klotho對RIF的抑制作用[6,8]。證據顯示，Klotho可以調控體內多條致纖維化信號通路，如轉化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、Wnt/β-聯蛋白(β-catenin)、腎小管上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)、FGF-2、內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)等多條纖維化相關信號通路，從而多靶點抑制RIF的發生發展[7]。

1.1抑制TGF-β1信號通路 TGF-β1及其下游Smads蛋白是經典的致纖維化通路，TGF-β1與其受體結合后，通過調控Smads蛋白的磷酸化而激活致纖維化基因的轉錄，其中Smad2/3起正調控作用，Smad7通過競爭性結合TGF-β1的受體阻斷Smad2/3的磷酸化，負向調控TGF-β1的作用。一項關于糖尿病腎病患者的調查表明，血清可溶性Klotho水平隨著蛋白尿的增加逐漸下降，而血清TGF-β1的水平逐漸升高，兩者呈顯著負相關[9]，提示Klotho的減少可能與TGF-β1信號的激活有關。在單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)腎臟纖維化模型中發現，Klotho基因缺陷會加重TGF-β1誘導的RIF的形成，而野生型小鼠或給予外源性可溶性Klotho治療則抑制了TGF-β1導致的RIF[10]。近期的研究也發現，Klotho基因剔除會導致TGF-β1及其下游信號的激活，加重UUO誘導的RIF[11]。在糖尿病腎病模型中，Klotho缺失在不影響腎臟血流的情況下，促進了腎小球的肥大及系膜基質的增生，上調了TGF-β1及磷酸化Smad2的表達，而Klotho表達增加則可逆轉以上改變[12]。體外實驗表明，Klotho抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell，RTC)內TGF-β1的活性，并降低TGF-β1的Ⅱ型受體含量，減少纖維化標志物的產生[13]。綜上，證實了Klotho對TGF-β1及其下游纖維化信號的抑制作用。在Klotho抑制TGF-β1信號的機制研究中，Doi等[14]發現，可溶性Klotho與TGF-β1的Ⅱ型受體有較高的親和力，可溶性Klotho與TGF-β1的Ⅱ型受體結合后影響了與TGF-β1的結合，干擾了TGF-β1和Smad信號轉導，類似于Smad7轉錄抑制作用，這可能是Klotho抑制TGF-β1信號的機制，但這種結合是競爭性的或是由變構效應導致的尚不明確。

1.2干擾Wnt/β-catenin信號通路 經典Wnt信號的激活也與器官纖維化包括腎臟纖維化的發生發展相關[15]。Wnt蛋白是一種分泌型糖蛋白，共有19種，是Wnt/β-catenin信號通路的起始蛋白。正常細胞內β-catenin與其他物質形成復合物，導致β-catenin 的磷酸化而被蛋白酶降解，使胞內游離的β-catenin處于低水平狀態；當Wnt信號激活后抑制了β-catenin磷酸化，導致胞內游離的β-catenin增多而移位，致細胞核與核內轉錄因子結合，調控下游多種與纖維化有關的基因轉錄(fibronectin、基質金屬蛋白酶7、Twist及Snail等)[16]。在衰老的小鼠模型中發現，Klotho缺失引起Wnt信號的激活并觸發了細胞老化，說明Klotho對Wnt信號通路具有調節作用[17]。在UUO模型中也發現，Wnt信號的多種成分(如Wnts、β-catenin、fibronectin)的表達在RIF中明顯上調，而Klotho轉基因小鼠RIF減輕，同時Wnts、β-catenin、fibronectin的表達也明顯減少[18]。體外實驗也證實，可溶性Klotho對心肌細胞和RTC細胞的Wnt/β-catenin信號通路具有抑制作用[18-19]。在阿霉素誘導的腎損傷模型中，隨著腎損傷時間的延長，腎組織可溶性Klotho的表達強度逐漸減少，而β-catenin 的強度卻逐漸增多，且兩者呈負相關；進一步分析發現，可溶性Klotho一方面能與免疫標記的Wnt1、Wnt4或Wnt7a等結合形成復合物；另一方面Klotho也直接抑制了β-catenin的核內移位[20]，說明Klotho通過干擾Wnt和β-catenin的作用使經典的Wnts/β-catenin致纖維化通路失活。

1.3抑制腎臟EMT EMT是指上皮細胞失去原有的細胞表型，而獲得間充質細胞表型的過程，發生EMT的細胞結構與功能發生改變，在腫瘤轉移及纖維化形成中發揮重要作用[21]。RIF伴隨大量肌纖維母細胞的激活，繼而產生大量細胞外基質，促進RIF發生發展。有研究表明，RTC經EMT途徑可以產生RIF所需的大約36%的肌纖維母細胞[22]。雖然近年來對EMT在器官纖維化中的作用有爭議，但并不能完全否認EMT的作用[23]。在經典的UUO模型中，Klotho基因缺失可以上調腎組織肌纖維母細胞標志物α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達，同時下調上皮性標志物上皮鈣黏素(E-cadherin)的表達，減輕RIF[10]。EMT的激活及Klotho的減少也是環孢素A(cyclosporine A，CsA)腎毒性的一個重要發病機制。近期的研究顯示，CsA引起了腎組織EMT標志物的改變，外源性可溶性Klotho治療緩解了CsA誘導的腎組織EMT過程，抑制了CsA相關的RIF[24]。體外實驗表明，可溶性Klotho可以使FGF-2刺激的人腎皮質近曲小管上皮細胞2(human kidney-2 cell， HK-2)細胞形態向上皮樣細胞轉變，并上調HK-2細胞E-cadherin的表達，抑制α-SMA的表達[25]，這表明可溶性Klotho抑制了FGF-2誘導的EMT。來自Klotho基因變異小鼠的RTC體外分離培養也發現，Klotho缺失增強了TGF-β1誘導的EMT改變[26]。通過藥物間接增加腎臟Klotho的合成，顯著抑制腎臟α-SMA的表達，上調了E-cadherin的表達，進一步驗證了Klotho對EMT的抑制作用[27]。Klotho抑制EMT的機制尚不明確。TGF-β1是引起EMT過程的主要細胞因子，而Snail則是調控EMT的主要轉錄因子，同時又是Wnt/β-catenin的主要下游靶基因，因此，Klotho對EMT的影響可能是通過間接調控TGF-β1和Wnt/β-catenin通路實現的。

1.4調控RAS RAS的激活在CKD發病及進展中的作用已經取得共識，對RAS的抑制是延緩CKD進展的一個主要干預靶點。RAS的激活、Klotho降低以及FGF-23水平的升高是CKD患者的共有特征，它們之間存在復雜的交叉對話，RAS的激活降低了Klotho的表達，而Klotho也調控了RAS的活性，協同參與了CKD的進展[28]。在5/6腎切除模型、UUO及阿霉素腎病模型中均發現，模型組動物腎組織Klotho的表達顯著降低，而RAS的多種成分(如腎素、血管緊張素轉換酶)的表達顯著提高，Klotho基因轉染則抑制了上述物質及纖維化因子TGF-β1、α-SMA的表達，改善了腎臟病變；體外實驗也表明，可溶性Klotho能劑量依賴性地抑制RTC細胞內腎素、血管緊張素轉換酶及纖維化因子的表達[29]。在另一個阿霉素腎病模型中發現，模型組動物血清及腎組織中腎素、血管緊張素Ⅱ表達上調，Klotho表達下降，而外源性可溶性Klotho治療則減少了腎素、血管緊張素Ⅱ的表達，緩解了RIF；而在Klotho抑制RAS的機制研究中發現，若同時應用Wnt/β-catenin抑制劑則阻斷了Klotho對RAS的抑制作用，說明Klotho對RAS的調控可能部分依賴于Wnt/β-catenin的作用[30]。已有研究表明，所有RAS成分基因的啟動子區域均含有β-catenin的結合位點，因此，Wnt/β-catenin 作為RAS上游調控因子調控了RAS的表達[31]，Klotho對RAS的抑制可能與Wnt/β-catenin有關。

1.5抑制FGF-2信號通路 FGF-2也是一個促纖維化因子，參與了肝臟、心肌及肺組織的纖維化的過程，也與腎臟纖維化的發生發展有關[32]。研究表明，FGF-2及其受體在RIF中的表達顯著上調，且與RIF的程度密切相關[33]。FGF-2與其腎組織FGF-2的1型受體結合后，導致下游胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2的磷酸化而激活下游靶基因的轉錄；可溶性Klotho可以抑制腫瘤細胞內FGF-2水平及下游ERK1/2的激活，抑制腫瘤的增生及轉移，說明Klotho對FGF-2信號具有調控作用[34]。體內研究表明，外源性可溶性Klotho治療降低了UUO模型中FGF-2的水平，同時抑制了ERK1/2的激活及肌纖維母細胞的激活，減輕了RIF；體外實驗也進一步證實，一方面可溶性Klotho可以劑量依賴性地降低FGF-2誘導的HK-2細胞ERK1/2的磷酸化，同時競爭性地與FGF-2的1型受體結合；另一方面FGF-2可以使培養的HK-2細胞形態發生改變，同時上皮性標志物E-cadherin表達減少，肌纖維母細胞標志物α-SMA表達增多，而可溶性Klotho干預后FGF-2及ERK1/2的磷酸化水平均降低，并逆轉了HK-2細胞形態改變以及E-cadherin 和α-SMA的表達，說明可溶性Klotho對FGF-2信號的抑制也影響了腎臟EMT過程[25]。目前已知，Klotho是FGF因子的協同受體，可與FGF受體結合形成復合物。Klotho與FGF-23受體結合后可以促進FGF-23的結合，發揮鈣磷調節的作用，但與FGF-2受體結合后干擾了FGF-2與其受體的結合[35]，從而抑制了FGF-2介導的致纖維化過程。

1.6抑制ERS ERS是新發現的與器官纖維化有關的通路。研究表明，UUO誘導的RIF伴隨ERS標志物的大量表達，表明ERS被激活，而抑制ERS能緩解UUO誘導的RIF[36]，說明ERS也是RIF發生的一個促進因素[37-38]。缺氧及氧化應激等是ERS的常見激活誘因，而Klotho具有抗氧化作用，推測Klotho可能對ERS具有調節作用。來自冠心病患者的心肌活檢顯示，心肌細胞Klotho的表達明顯減少，而ERS標志物葡萄糖調節蛋白78的表達顯著增多，說明Klotho的減少可能與ERS的激活有關[39]。Song等[40]發現，異丙腎上腺素可以誘導心肌細胞大量活性氧的產生，并上調ERS標志物[如葡萄糖調節蛋白78、熱激蛋白47及C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)]的表達，而可溶性Klotho干預后則減少了活性氧類的產生，抑制ERS標志物的表達，緩解了ERS相關的心肌肥厚。體外實驗也表明，可溶性Klotho緩解了藥物誘導的HK-2細胞ERS反應，減輕活性氧類導致的HK-2損傷，而Klotho基因剔除則阻斷了這種保護效應[41]。進一步的研究也證實，UUO引起的RIF伴隨腎組織ERS標志物葡萄糖調節蛋白等的增多，而可溶性Klotho替代治療下調了這些標志物的含量，抑制了ERS，并減輕了RIF[42]。因此，可溶性Klotho對ERS具有調節作用，調控ERS的機制可能與其對氧化應激的調控有關，但具體機制尚不明確。

總之，RIF發生機制復雜，多條致纖維化通路之間也存在復雜的交叉對話，而Klotho抗RIF的作用也是多靶點的。除了以上機制以外，Klotho能否調控其他與纖維化有關的通路(如哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白、胰島素樣生長因子1、Toll樣受體等信號通路)，還需要在以后的研究中進一步闡明。

2 Klotho的應用價值

RIF是CKD進展至終末期腎病的最終通路，而Klotho表現出明顯的RIF抑制作用，這為CKD相關RIF的防治提供了新方向，值得關注。目前已知，CKD伴隨Klotho的明顯減少，而Klotho的減少反過來又加重了RIF的程度，促進了CKD的進展。因此，調控體內Klotho的表達，理論上具有抑制RIF防治CKD的作用。通過基因工程手段導入Klotho的基因序列是提高Klotho水平的理想調控手段，但目前只限于基礎研究；而直接給予外源性Klotho替代治療，是發揮Klotho抑制RIF的最直接手段，這在多種動物實驗中已經得到證實[19, 24, 42]。而通過藥物間接調控體內Klotho的表達，也是發揮Klotho作用的一個新方法。我國傳統中藥單體(如姜黃素和大黃酸)，被證實可以上調Klotho的表達水平，緩解了CsA或UUO誘導的RIF[43-44]。RAS抑制劑纈沙坦也被證實可上調糖尿病患者血清可溶性Klotho濃度，而可溶性Klotho水平的上升伴隨白蛋白尿的減少及糖尿病腎病進展的延緩[45]。抗氧化劑也被發現能劑量依賴性地升高CsA腎毒性動物模型中腎組織Klotho的表達，緩解 RIF[46]。綜上，說明通過多種手段，直接或間接增加Klotho的表達，確實能減輕RIF，這對RIF的防治而言意義重大，具有臨床應用價值。

3 小 結

RIF的發生發展涉及多種細胞因子、信號通路的作用，因而其防治也是多靶點、綜合治療的過程。作為重要的腎臟保護因子，Klotho顯示出了調控多種信號通路的致纖維化效應，通過多靶點的作用最終發揮RIF的抑制功能，是一個很有發展前途的抗RIF因子。然而，CKD被認為是腎臟保護因子Klotho的缺乏狀態，而Klotho的缺乏可能進一步加劇RIF，長遠來看，也增加了腎功能惡化的風險，這在近期的前瞻性研究中已被證實[47-48]。因此，將來如何以Klotho為設計靶點，調控Klotho的表達，進而充分發揮Klotho的抗纖維化作用，對RIF的防治而言可能是一個新的干預策略，值得進一步研究。