LOX-1在動脈粥樣硬化形成過程中的作用研究進展

秦雅紅，張振剛，焦云根,※

(1.揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225000； 2.揚州大學附屬醫院心內科，江蘇 揚州225000)

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是當今世界各國人口死亡率上升的主要原因，基本病理變化為動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化是一種與年齡相關的大、中型動脈緩慢發展的疾病，其形成是一個復雜的、受多種致病因素影響的病理生理過程，包括血管內皮損傷、黏附分子表達、白細胞趨化、單核細胞募集、脂質積累、平滑肌細胞增殖遷移和泡沫細胞形成。據報道，血管中低密度脂蛋白的累積是血管壁動脈粥樣硬化斑塊形成的主要原因；血液中存在溶解氧和其他氧化物質，這些物質對抗氧化物有較強抵抗力且在血管中停留的時間更長，可促進低密度脂蛋白顆粒化學氧化，由此產生的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-denisty lipoprotein，ox-LDL)能促進更多ox-LDL和其他促炎細胞因子的生成，從而形成一種惡性循環反應[1]。這一病理過程是通過一種叫作凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low-denisty lipoprotein receptor-1，LOX-1)的清道夫受體介導實現的，LOX-1由Sawamura等[2]于1997年在牛主動脈內皮細胞首次發現，能夠與ox-LDL結合，在動脈粥樣硬化形成過程中發揮重要作用。所以，進一步了解LOX-1在動脈粥樣硬化形成機制中的作用顯得尤為重要。LOX-1可能作為一種潛在治療靶點服務臨床，降低ACS的發生率和死亡率。現就LOX-1在動脈粥樣硬化形成過程中的作用研究進展予以綜述。

1 LOX-1的基因結構及表達

1.1LOX-1的基因結構 LOX-1[3]屬于E類清道夫受體，是一種分子量為50 000的Ⅱ型膜表面糖蛋白，隸屬C型凝集素超家族，由273個氨基酸殘基組成。LOX-1[1]由ox-LDL受體1基因編碼，ox-LDL受體1基因為單拷貝基因，位于染色體12p12.3～13.2區域，是一個在5′側翼區近端具有TATA和CAAT盒的誘導基因，TATA盒位于-29 bp，CAAT盒位于-99 bp。LOX-1[3]與自然殺傷基因復合體相似，與其他自然殺傷細胞受體相同，均由四個區域組成，包含一個短的N端細胞質域、一個跨膜域、一個控制受體寡聚的頸部區域和一個細胞外C型凝集素樣結構。人類LOX-1基因[1]全長7 000 bp，由6個外顯子和5個內含子組成，外顯子1～5的大小從102到246 bp不等，第6個外顯子更長(1 722 bp)。5′非翻譯區和胞質域由外顯子1編碼，其余胞質域和跨膜域由外顯子2編碼，頸部區域由頸部域或外顯子3編碼，外顯子4～6編碼凝集素樣結構域和3′非翻譯區，C型凝集素是一種識別并結合特定糖類靶標的蛋白質，LOX-1與C型凝集素的序列具有同源性。誘變研究表明，LOX-1的凝集素域是識別LOX-1配體的功能域，C端殘基和幾個橫跨凝集素域的保守正電荷殘基是ox-LDL結合的必要條件[2]。在N端的細胞質結構域中存在幾個磷酸化位點，這些位點的磷酸化可傳遞生物信號或調節LOX-1的功能。

1.2LOX-1的表達及信號轉導 LOX-1最早被鑒定為血管內皮細胞攝取ox-LDL的主要受體[3]，隨后發現LOX-1也在心肌細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、動脈粥樣硬化斑塊、血小板中表達[4]。LOX-1在生理條件下表達較低，參與ox-LDL的結合、內吞和蛋白降解，但LOX-1可在多種疾病狀態中上調，例如高血壓(血管緊張素Ⅱ、內皮素-1)，糖尿病(葡萄糖)，缺氧和機械應激(剪切應力)[5]，腎小球硬化，促炎細胞因子(腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β)等。LOX-1的表達不但受某些疾病調控，解剖位置對其也至關重要，Chen等[6]發現在動脈分叉處LOX-1的表達增加最為顯著，這可能是因為位于分叉處的內皮細胞受到復雜(慢性、階段性和紊亂性)剪切力和周向應變的聯合作用。ox-LDL與LOX-1特異性結合，會涉及多種信號通路，如促分裂原活化的蛋白激酶(p38、胞外信號調節激酶1/2、c-Jun氨基端激酶)，激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)，沉默信息調節因子1，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，八聚體結合蛋白-1，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nitotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases，Noxs)，血管緊張素Ⅱ1型受體，蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶，每種信號通路的激活可能參與動脈粥樣硬化的不同過程[7]。

2 LOX-1在動脈粥樣硬化中的病理機制

2.1LOX-1促進血管內皮功能失調 動脈粥樣硬化始于血管內皮功能障礙，LOX-1是內皮細胞攝取ox-LDL的主要受體[8]；生理條件下，內皮細胞通過分泌一氧化氮或低劑量過氧化氫等血管舒張劑維持血管張力[9]。Hofmann等[10]研究表明，ox-LDL與內皮細胞LOX-1結合產生超氧化物陰離子，減少一氧化氮生成，同時通過活性氧類的增加激活NF-κB，誘導黏附分子產生，增加單核細胞與內皮細胞的黏附，以及內皮細胞的衰老和凋亡。內皮細胞的凋亡可導致內皮功能障礙、動脈粥樣硬化的發生和進展過程中血栓形成以及動脈粥樣硬化斑塊的不穩定。Li和Mehta[11]發現，定向于LOX-1 mRNA的反義寡核苷酸可以抑制ox-LDL介導的單核細胞趨化蛋白-1上調和黏附分子的表達，這意味著抑制LOX-1是保護內皮功能受損和預防動脈粥樣硬化形成的重要靶點。

構成血管壁最內層的內皮細胞暴露于流體剪切應力(fluid shear stress，FSS)中，FSS調節內皮功能和血管病理生理。Lee等[12]研究發現，LOX-1在內皮細胞中的表達受FSS模式和強度的調控，并將FSS分為穩定的單向層狀剪切應力(laminar shear stress,LSS)和擾動的振蕩剪切應力(oscillatory shear stress,OSS)兩種模式，其中LSS被認為通過誘導抗動脈粥樣硬化基因發揮動脈粥樣硬化保護作用，而OSS則被認為通過增加促炎基因和黏附分子的表達產生致動脈粥樣硬化性。內皮細胞通過感知血流量的不同模式，檢測FSS并轉化為內部信號，在此過程中，FSS激活由血管內皮生長因子受體2、血管內皮細胞鈣黏附素和血小板內皮細胞黏附分子-1組成的機械感覺復合體，完整的機械感覺復合體允許細胞對不同的剪應力做出反應，并將機械力轉換成生物信號，響應流量的變化[12-14]。

Kruppel樣轉錄因子2(Kruppel-like factor 2，KLF2)作為炎癥的調節因子，在人血管內皮細胞中表達，通過抗炎、抗血栓和抗遷移功能等發揮動脈粥樣硬化保護作用，KLF2-AP-1是FSS調控內皮細胞中LOX-1表達的關鍵通路[15]。Lee等[12]通過siRNA 和質粒轉染，人工調控KLF2表達發現，KLF2的下調增加了LSS中LOX-1的表達，而過表達則抑制OSS中LOX-1的上調，說明KLF2的活化是FSS中LOX-1表達的關鍵因素。Lee等[12]研究了靜態、LSS、OSS條件下LOX-1(mRNA和蛋白)的表達水平，結果顯示LOX-1的表達在低OSS水平下顯著增加，與LSS相比，低流量和擾動流可上調內皮細胞中LOX-1的表達，靜態條件下細胞LOX-1表達水平高于LSS。因此，LSS通過使LOX-1的表達低于OSS和靜息狀態，發揮動脈粥樣硬化的保護作用。生理作用下的LSS，通過KLF2-AP-1通路抑制LOX-1的表達，而超過生理范圍的高剪切應力亦是由KLF2-AP-1 途徑介導，但LOX-1的表達卻呈增加趨勢；病理下的高剪切應力表達了類OSS特征，如磷脂酰肌醇-3-激酶、磷酸化內皮型一氧化氮合酶、磷酸化蛋白激酶B、磷酸化胞外信號調節激酶水平較低，細胞間黏附分子1和血管細胞黏附分子1水平較高[12]。事實上，已有報道斑塊模型中脂質核心節點的FSS均值比正常血管節點高45%，提示脂質豐富壞死核心區域與高剪切應力相關[16]。

Hong等[17]研究證實，LOX-1通過內質網應激通路在ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡中發揮重要作用。內質網是介導細胞死亡的重要細胞器，內質網中未折疊或錯折疊蛋白在各種損傷積累下觸發內質網應激并干擾內質網功能，開放蛋白反應能被內質網跨膜傳感器激活，作為一種自衛機制，抵消內質網應激產生的損傷，然而，即使內質網應激被解除，細胞仍可能受到損傷或死亡[18]。Hong等[17]發現ox-LDL以劑量和時間依賴方式誘導內皮細胞凋亡，ox-LDL誘導的細胞凋亡與內質網應激通路相關，涉及凋亡基因胱天蛋白酶-12和CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein，CHOP)的激活，CHOP在內質網啟動的細胞凋亡途徑中參與蛋白質的轉錄抑制，能抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達，胱天蛋白酶-12存在于內質網的細胞質側，被內質網應激源特異性激活，在內質網應激通路中亦發揮關鍵作用[19]，內質網應激的嚴重程度和持續時間決定了細胞的存活或死亡[17]。Noxs是內皮細胞的信號分子，在氧化應激誘導的血管損傷現象中發揮重要作用，Nox-4作為Noxs中的一員，是內皮細胞內質網中超氧陰離子和過氧化氫的主要來源[17]，介導7-酮膽固醇誘導的內質網應激和凋亡，而ox-LDL上調Nox-4能使內質網氧化還原穩態顯著破壞，導致細胞凋亡，LOX-1在這一過程中發揮關鍵作用。這些發現有助于進一步闡明LOX-1在內皮細胞凋亡過程中的具體機制。

2.2LOX-1加速泡沫細胞形成

2.2.1平滑肌-泡沫細胞 在動脈粥樣硬化形成過程中，中層的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)發生分化、增殖并遷移至內膜，形成纖維帽和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，ECM主要由巨噬細胞產生的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解，ox-LDL通過調節巨噬細胞中MMP的表達來促進斑塊的不穩定性。此外，由于易損斑塊纖維帽區域通常較薄，VSMCs較少，因此ox-LDL誘導的內膜VSMCs凋亡亦可增加斑塊不穩定性。閆杰等[20]研究表明在VSMCs中，ox-LDL結合LOX-1可通過促凋亡因子(Bax)/抗死亡因子(Bcl-2)依賴途徑誘導VSMCs凋亡。維持正常細胞線粒體外膜完整性的Bcl-2蛋白家族Bcl-2、Bcl-xL和髓樣細胞白血病-1是抗凋亡介質，而其他Bcl-2家族成員，如Bax、Bak、Bid等，能夠促進細胞凋亡，因此抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達比例可能決定細胞的凋亡潛能[21]。Bcl-2和Bax共同定位于人體內動脈粥樣硬化斑塊破裂易發區，ox-LDL能上調VSMCs中Bax的表達，Bax的升高和Bcl-2的降低均依賴于LOX-1介導的ox-LDL攝取或結合[22]，Bax/Bcl-2比值的增加致線粒體膜電位變化，促使細胞色素C釋放，胱天蛋白酶活化，從而誘導VSMCs凋亡、血管壁損傷，加速動脈粥樣硬化斑塊形成[20]。

Ding等[21]利用LOX-1的關鍵調控因子miRNA hsa-let-7g研究了LOX-1在VSMC自噬和凋亡中的作用。自噬是一種保守的細胞內降解過程[23]。細胞凋亡是氧化應激的一種反應，通過LOX-1在人內皮細胞和VSMCs中的激活而介導[24-25]。Ding等[21]通過測定內皮細胞VSMCs中三種不同標志物beclin-1、LC3和Atg5評估自噬：hsa-let-7g轉染VSMCs可降低LOX-1表達和活性氧類生成，提高細胞活力，過表達hsa-let-7g能抑制自噬標志物beclin-1、LC3和Atg5的表達，提高VSMCs的存活率。同樣，過表達hsa-let-7g抑制劑對自噬和凋亡的影響相反，所以，hsa-let-7g的作用與LOX-1抗體相似，通過調控胱天蛋白酶-3、Bax、Bcl-2和Bcl-xL影響細胞凋亡。因此,hsa-let-7g有可能成為進一步研究動脈粥樣硬化的潛在治療靶點。

2.2.2單核-巨噬-泡沫細胞 脂質被巨噬細胞吞噬形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化的早期事件。單核細胞被促炎刺激吸引，附著在炎癥血管內皮上，遷移至內膜下層并在內膜下積累，隨之分化為巨噬細胞并吞噬ox-LDL形成泡沫細胞。巨噬細胞內脂質平衡被破壞導致膽固醇的積累和泡沫細胞的形成[3]，泡沫細胞是脂肪條紋的重要組成部分，是斑塊中最易破裂的主要細胞類型，減少泡沫細胞形成或低密度脂蛋白膽固醇吸收可減輕動脈粥樣硬化斑塊的形成[26]。

AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的活化有助于心血管健康[27]。Chen等[8]發現AMPK在泡沫細胞轉化，特別是在巨噬細胞攝取膽固醇中有重要作用。活化的AMPK導致巨噬細胞膽固醇攝取減少，抑制ox-LDL介導的巨噬細胞泡沫細胞形成，這種功能的改變是由LOX-1的mRNA和蛋白表達下調引起的。實驗細胞培養模型研究發現，AMPK通過蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A，PP2A)/NF-κB/LOX-1途徑對ox-LDL攝取起作用，PP2A是一種蛋白質絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，被確定為NF-κB的關鍵調節因子，PP2A在AMPK激活時對p65磷酸化的調節起關鍵作用，活化的AMPK刺激NF-κB去磷酸化從而降低LOX-1的表達，相反AMPK則通過促進p65的去磷酸化誘導LOX-1增加，這進一步證實AMPK通過控制NF-κB 轉錄活動參與LOX-1的表達。ApoE-/-小鼠體內實驗表明[28]：當巨噬細胞暴露于H007或AICAR(AMPK激動劑)時可增加PP2A磷酸酶活性，刺激NF-κB去磷酸化從而降低LOX-1的表達，縮小動脈粥樣硬化斑塊的面積，這些結果表明AMPK參與PP2A介導的NF-κB去磷酸化和LOX-1的下調。AMPK激活的潛在機制不同，但AMPK對LOX-1表達的調節機制是明確的，AMPK通過抑制膽固醇對巨噬細胞的攝取而發揮抗動脈粥樣硬化作用。

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是一種參與脂質代謝和細胞凋亡的脂質調節蛋白，可以影響巨噬細胞生物學功能和調節動脈粥樣硬化的發生[29]。炎癥在動脈粥樣硬化形成過程中至關重要，單核細胞/巨噬細胞是炎癥免疫激活級聯反應的重要組成部分，Giunzioni等[30]指出脂多糖刺激巨噬細胞中的PCSK9可以增加促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α和IL-1β的mRNA水平，并且在低密度脂蛋白受體依賴性機制中抑制抗炎細胞因子IL-10和Arg1的轉錄水平。PCSK9是一種炎性分子,可能在促炎環境增進ox-LDL攝取中發揮重要作用。有研究指出腫瘤壞死因子-α可以顯著增加巨噬細胞PCSK9表達，暗示炎癥狀態可以在轉錄水平上增加巨噬細胞中PCSK9 的表達，同時PCSK9又可激活腫瘤壞死因子-α引發的巨噬細胞清道夫受體LOX-1的表達， PCSK9和腫瘤壞死因子-α相互作用，通過加重炎癥反應和ox-LDL的攝取發揮動脈粥樣硬化作用[31]。

對PCSK9轉基因(PCSK9trans)巨噬細胞進行研究，發現PCSK9trans巨噬細胞中的ox-LDL攝取顯著增加[31]。ATP結合盒轉運蛋白A1和ATP結合盒轉運蛋白G1[ATP-binding cassette (ABC) transporter G1, ABCG1]在單核巨噬-泡沫細胞的膽固醇流出中起關鍵作用，ATP結合盒轉運蛋白A1是反向膽固醇運輸的關鍵蛋白質，促進巨噬細胞膽固醇流出，防止泡沫細胞的形成。ABCG1 是一種活躍的脂質轉運體，在巨噬細胞中表達并參與反向膽固醇運輸，ABCG1表達可抑制膽固醇過度積累，減少泡沫細胞的形成[32-33]。PCSK9通過抑制反向膽固醇運輸、引起炎癥反應和膽固醇積累在巨噬細胞中上調，并通過增強巨噬細胞對膽固醇的吸收而加速動脈粥樣硬化的發生發展[34]。

2.3LOX-1影響動脈粥樣斑塊穩定性 動脈粥樣硬化斑塊由覆蓋有纖維帽的脂質核心組成，纖維帽主要由含有大量膠原纖維的ECM、平滑肌細胞和少量巨噬細胞組成；脂質核心由巨噬細胞、平滑肌細胞和ECM組成。動脈粥樣硬化斑塊分為穩定斑塊和不穩定斑塊，不穩定斑塊表現為纖維帽潰瘍、斑塊破裂、斑塊內出血，是心絞痛、心肌梗死的發生基礎。ox-LDL與LOX-1結合介導多種生物學效應，導致動脈粥樣硬化斑塊失穩，不穩定斑塊一般有較大脂核，薄弱纖維肌帽，單核細胞誘導的促炎反應增強等特征。MMPs的表達更容易使斑塊發生破裂。MMPs主要由巨噬細胞釋放，活化后的MMP對ECM的親和力更高，可降解各種ECM成分，削弱纖維帽結締組織，從而增強斑塊的不穩定性[35]。

Ishino等[36]通過免疫組織化學分析了LOX-1表達與家兔斑塊不穩定性的關系，結果發現LOX-1表達與斑塊不穩定性指數和MMP-9表達呈正相關，LOX-1在纖維肌帽較薄(<100 μm)的動脈粥樣硬化斑塊中表達增加，在巨噬細胞豐富的脂質核心區表達更為明顯。這些結果表明LOX-1與動脈粥樣硬化斑塊的穩定性密切相關，MMP-9可能是LOX-1與斑塊不穩定性之間的橋梁。MMP蛋白家族強大，除MMP-9外，其他家族成員亦被相繼發現，其中MMP-1通過降解斑塊內膠原蛋白促進斑塊擴張、破裂和出血；MMP-2通過降解ECM和消除細胞-基質相互作用促進斑塊破裂并誘導VSMCs凋亡；MMP-12通過降解ECM組分促進動脈粥樣硬化的進展。

Hu等[35]發現在晚期動脈粥樣硬化家兔中，MMP-1、MMP-3和MMP-9的上調和MMP-14的下調會導致斑塊中的血管生成和斑塊不穩定性的增加。陳潤泰等[37]研究表明，血管新生在動脈粥樣硬化的發生發展中發揮重要作用，斑塊破裂與微血管形成增加密切相關；易損斑塊內營養血管數量是穩定斑塊內營養血管數量的2～4倍，動脈粥樣硬化斑塊及其穩定性與血管生成密切相關，為進一步研究動脈粥樣硬化斑塊穩定性提供方向。

3 小 結

LOX-1是一種在血管細胞(內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞)中普遍表達的多功能受體，與動脈粥樣硬化的發生、發展以及動脈粥樣硬化斑塊的穩定性密切相關。LOX-1的致病機制復雜，不僅局限于心腦血管疾病，在肺動脈高壓、胃腸疾病、類風濕疾病、糖尿病及腫瘤的發生發展中都起著重要作用，因此研究LOX-1對心腦血管疾病與其他類型疾病機制的相關性也至關重要。隨著人們從LOX-1角度研究動脈粥樣硬化發病機制的不斷深入，冠心病靶向治療越來越受到重視，在精準醫療模式背景的推動下，LOX-1基因干預、LOX-1靶向抑制劑可能為心血管疾病的預防、治療及預后提供新的診療思路和方向。