表觀遺傳機制在酒精精神依賴過程中的研究進展

陳增榮,謝曉巖,薛琳媛,李鳳青,殷麗天

(細胞生理學教育部重點實驗室，山西醫科大學基礎醫學院，太原 030001)

酒精是使用最廣泛的成癮藥物之一，長期持續使用和濫用可導致耐受性和依賴性。酒精成癮是一種嚴重的精神類疾病，給個人生活以及社會造成巨大的經濟負擔[1]。表觀遺傳學是指在基因組中除了DNA和RNA序列以外，還有許多調控基因的信息，雖然本身不改變基因的序列，但是可以通過基因修飾，蛋白質與蛋白質、DNA和其他分子的相互作用而影響和調節遺傳基因的功能和特性，并可通過細胞分類和增殖周期影響遺傳。表觀遺傳包括組蛋白修飾、磷酸化、甲基化、泛素化等翻譯后修飾，組蛋白乙酰化與轉錄活性狀態相關，而某些堿性氨基酸殘基的組蛋白甲基化會促進轉錄抑制[2]，DNA內胞嘧啶堿基的直接甲基化受基因活性的影響，此外微RNA(microRNA，miRNA)也參與調節轉錄后基因的表達和功能。特定表觀遺傳機制在疾病的發生和發展期間起著關鍵作用[3]。體內一些表觀遺傳修飾的穩定性較高，但很多形式的染色質修飾是可逆的，但如何控制特定染色質在修飾過程中的瞬時與穩定性仍然未知[4]。

有研究認為，導致基因表達可遺傳變化的機制是其他過程引起的，而不是基礎DNA序列變化(即表觀遺傳機制)引起的[5]，表觀遺傳可使人們更好地理解人類疾病的分子機制，包括精神病和酒精使用障礙。現就近幾年來表觀遺傳機制在酒精精神依賴發展中所起的作用進行綜述。

1 組蛋白修飾

目前在轉錄調節中有重要功能的組蛋白共價修飾包括乙酰化(賴氨酸殘基)、甲基化(精氨酸和賴氨酸殘基)、磷酸化(絲氨酸和蘇氨酸殘基)、泛素化、ADP-核糖基化(賴氨酸殘基)以及脯氨酸異構化。在酒精依賴和酒精濫用的相關研究中發現，組蛋白H3和H4的乙酰化和磷酸化與激活轉錄有關，而泛素化與轉錄抑制有關[6]。

1.1組蛋白乙酰化 組蛋白乙酰化反應多發生在核心組蛋白H3和H4 N端的特定Lys殘基上，H3乙酰化位點包括Lys9、Lysl4、Lys18和Lys23；H4乙酰化位點包括Lys5、Lys8、Lys12和Lys16[7]，這一過程是由組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)調節。組蛋白乙酰化可以降低組蛋白的正電荷，減弱組蛋白與帶負電荷的DNA的相互作用。研究發現，基因表達的下降與基因啟動子區域乙酰化程度的降低有關，這是由于HDAC通過去除乙酰基抑制HAT的活性，從而導致染色質構象的凝聚和細胞中基因表達水平的降低[8]。組蛋白的乙酰化與成癮性記憶的形成密切相關。在成癮過程中，HAT和HDAC調節組蛋白乙酰化的機制與cAMP應答元件結合蛋白(cyclic-AMP responsive-element binding，CREB)信號通路有關。CREB磷酸化后被激活，通過與DNA上的特定序列結合，調節某些基因的轉錄。磷酸化的CREB募集另一種稱為CREB結合蛋白的轉錄輔因子(CREB-binding protein，CBP)促進基因轉錄[9]。

在大鼠模型中，杏仁核環路中CREB的信號轉導在調節酒精相關行為和酒精抗焦慮中起重要作用[10]。急性給予乙醇后，杏仁核的中央和內側核發生CREB磷酸化，導致CBP的水平、組蛋白H3和H4乙酰化以及神經肽Y表達增加；另一方面，慢性酒精暴露戒斷后會產生相反的效果，導致CREB磷酸化、CBP和神經肽Y水平降低，這與焦慮的發展行為相對應[11]。腦源性神經營養因子是突觸可塑性的關鍵調節因子以及CREB的下游靶基因，也與酒精依賴和焦慮的共病有關[12]。也有研究顯示，酒精暴露會降低發育的小腦中CBP的表達和組蛋白乙酰化，這可能是導致與胎兒酒精譜相關的運動缺陷的原因[13]。以上發現提示，CREB信號通路在焦慮和酒精使用障礙中有重要作用。上述研究揭示了組蛋白乙酰化和去乙酰化通過動態調節基因轉錄，導致神經元可塑性的改變和酒精成癮行為。

酒精具有抗焦慮作用，但這種抗焦慮作用可被機體快速耐受，這種快速耐受性可能對促進飲酒至關重要，從而有助于酒精依賴的發病。研究發現，HDAC在酒精耐受性和依賴性中具有非常重要的作用。急性給予酒精后，大鼠杏仁核中HDAC的活性受到抑制，用強效HDAC抑制劑曲古抑菌素A治療可逆轉酒精抗焦慮作用快速耐受性行為的出現；反過來，酒精戒斷大鼠杏仁核中HDAC的活性增加，這與降低組蛋白乙酰化以及杏仁核和內側核中神經肽Y基因的表達相關[14]。在酒精戒斷期間，用曲古抑菌素A治療可防止焦慮樣行為的發生，糾正組蛋白乙酰化和神經肽Y表達的缺陷[9]。研究表明，CBP水平的變化可能參與急性和慢性酒精暴露引起的杏仁核動態染色質重塑[9]。急性酒精暴露可增加CREB磷酸化水平以及酒精偏好小鼠杏仁核結構中腦源性神經營養因子和細胞骨架相關蛋白的表達[15]。但是，通過CREB和CBP相互作用調節基因表達的表觀遺傳機制及酒精依賴的整體機制尚未明確，需要進一步研究。

1.2組蛋白甲基化 組蛋白甲基化是通過S-腺苷甲硫氨酸將甲基添加到賴氨酸和精氨酸殘基的ε-氨基上。組蛋白的甲基化大多發生在賴氨酸和精氨酸位點，目前發現的賴氨酸甲基化位點包括H3的Lys4、Lys9、Lys27、Lys36、Lys79和H4的Lys20。有證據表明，DNA和組蛋白上的某些賴氨酸和精氨酸殘基的甲基化可能涉及一個環路，存在相互加強的關系，是基因表達保持穩定或表觀沉默所必需的[16]。組蛋白的甲基化過程是由組蛋白甲基轉移酶和組蛋白去甲基化酶控制的。不同賴氨酸殘基甲基化作用是不同甚至相反的，有的與基因活化相關，有的與基因抑制相關。H3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)和H3賴氨酸36的三甲基化(H3K36me3)分別與轉錄起始和延伸高度相關，通常與轉錄活性水平的升高相關[17]，并通過H3K9和H3K14的乙酰化加強。已有研究表明，急性酒精暴露大鼠HDAC活性降低，導致H3K4me3增加，轉錄活性增加，同時H3K9me2減少，基因轉錄被抑制[18]。在可卡因成癮者和酒精依賴者的海馬中均發現了H3K4me3的改變，因此推測酒精和可卡因介導的表觀修飾機制是一樣的[19]。而H3賴氨酸9的二甲基化和三甲基化(H3K9me2/3)以及H3賴氨酸27的二甲基化和三甲基化(H3K27me2/3)通常與轉錄抑制相關，H3K9me3的轉錄沉默部分是通過募集共抑制蛋白(如異染色質蛋白1)調節的[17]。酒精依賴者伏隔核中H3K9me2的全面減少可能是由酒精誘導的兩種甲基轉移酶G9a和G9a樣蛋白下調所介導[20]，導致H3K9me2的去甲基化和H3K4me2增加，兩者最終都有助于開放的染色質狀態。因此，組蛋白甲基化是與酒精依賴密切相關的調節機制。

1.3組蛋白磷酸化 組蛋白的磷酸化是由蛋白激酶介導的，與轉錄激活、DNA修復和細胞周期動力學相關。組蛋白H3的磷酸化可以調節一些重要神經元途徑，如絲氨酸10處組蛋白H3的磷酸化與海馬中的情境恐懼條件模型有關[21]；蛋白激酶核糖體S6激酶2可以磷酸化H3和CREB，并且在CBP存在的情況下介導調節染色質重塑事件；在H3的絲氨酸10上阻斷磷酸化事件能夠減少對可卡因和嗎啡的行為反應，并阻止對可卡因的條件性位置偏好[6]。精神興奮類藥物，安非他明、可卡因以及嗎啡可增加組蛋白H3絲氨酸10的磷酸化，這進一步導致多巴胺和cAMP調節的磷蛋白32在細胞核中被隔離，從而抑制蛋白質-磷酸酶-1，最終促進磷酸化[22]。

總之，在不同酶途徑控制下的組蛋白側鏈殘基的共價修飾如乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化和磷酸化/去磷酸化是在急性或慢性暴露于酒精時改變相關腦組織轉錄組調控的重要調節機制。這些有助于了解酒精中毒的發生機制以及由酒精狀態引起并與之相關的長期神經適應。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是一種重要的基因表達表觀遺傳調控機制，可導致特定DNA序列中的基因沉默。DNA甲基化模式是由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)建立和維持的，然后這些模式被特定蛋白質識別。DNA甲基化主要由三種DNMT調節：DNMT 1保持DNA甲基化模式，而DNMT 3a和DNMT 3b參與DNA的從頭甲基化[9]。研究顯示，特定胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG島)的甲基化通過募集許多共抑制因子復合物，干擾轉錄因子與靶序列的結合，在含甲基結合結構域的蛋白如MeCP2和甲基化CpG結合蛋白1的作用下，將這種抑制性復合物募集到甲基化DNA中，其作用是進一步穩定基因啟動子上其他的共抑制子，如HDAC[6]。轉錄因子CREB的結合受基因啟動子處DNA甲基化影響，因為共有cAMP反應元件序列含有CpG島，當甲基化時，其阻止CREB與靶序列結合[23]。

對酒精依賴性者及其非酒精依賴兄弟姐妹的807個基因的1 505個CpG位點進行甲基化分析發現，前者整體甲基化水平較低[24]。另一個研究小組使用全基因組啟動子甲基化微陣列評估酒精依賴人群腦皮質的甲基化譜發現，與非酒精依賴者相比，近57%的酒精依賴者表現出低甲基化[25]。

也有研究得出相反的結論。慢性酗酒者與健康人群相比，外周血單核細胞中基因組DNA的甲基化水平顯著增加[26]。與對照組相比，酒精依賴者的淋巴細胞顯示出高甲基化，整體DNA甲基化增加，但DNMT3b表達減少[27]。在男性酒精受試者與非飲酒人群的比較發現，同型半胱氨酸誘導的內質網蛋白啟動子區甲基化狀態和內質網蛋白信使RNA的表達發生改變，其中酒精受試者內質網蛋白基因啟動子的高甲基化是下調基因表達的調節因子。通過比較過去6個月中飲酒女性與未飲酒女性的DNA甲基化模式發現，酒精消耗量與甲基化程度呈正相關[28]。

酒精對DNA甲基化的影響具有多樣性，包括一些基因啟動子的高甲基化和其他基因啟動子的低甲基化[29]。許多基因甲基化水平的改變與酒精依賴相關。與正常對照者相比，酒依賴者在參與認知控制的背外側前額皮質區域3′非翻譯區的突變體中表現出增強的甲基化以及腦中的前體啡肽發生單核苷酸多態性，并且前體啡肽3′非翻譯區單核苷酸多態性的甲基化與強啡肽基因表達之間呈正相關[30]。精氨酸加壓素基因的DNA高甲基化與酒精依賴密切相關，與此同時，心房利鈉基因啟動子區域的DNA發生低甲基化[31]。另一項研究顯示，酒精依賴者α-突觸核蛋白基因啟動子區域發生高甲基化，而α-突觸核蛋白與長期飲酒時伴隨高信使RNA和蛋白質水平造成的酒精依賴有關[32]。與健康對照相比，酒精依賴者血液中腦源性神經營養因子啟動子區域甲基化增加，但在酒精戒斷14 d后恢復到正常水平[31]。抽取無遺傳性疾病家族史的重度飲酒者的血樣用于DNA分離發現，配對狀同源框2a的甲基化與酒精依賴的嚴重程度呈正相關[27]。對酒精腦的全基因組DNA甲基化研究發現，與對照樣品相比，酒精腦DNMT1轉錄水平隨著大腦皮質區域中長末端重復反轉錄轉座子的DNA低甲基化而降低[33]。

此外，編碼N-甲基-D-天冬氨酸受體的基因其表達也受到DNA甲基化的調節。一項臨床研究證明，酒精依賴患者戒斷期間編碼N-甲基-D-天冬氨酸受體2B(N-methyl-D-aspartate 2b receptor subtype,NR2B)受體亞型基因啟動子區域的甲基化程度與飲酒嚴重程度呈負相關[34]。而在原代培養的神經元中，慢性間歇性酒精暴露導致NR2B亞型基因調控區的去甲基化，與NR2B基因表達增加相關[9]。然而，急性乙醇處理并未改變NR2B基因啟動子區域甲基化的水平和NR2B基因的表達[35]。使用慢性間歇酒精暴露模型觀察到位點特異性(轉錄因子AP-1和CREB的結合位點)DNA甲基化減少，其在乙醇戒斷后持續存在，而這些變化與慢性間歇乙醇誘導的NR2B表達相關[36]。

3 miRNAs

miRNAs是翻譯后調節因子，可與靶信使RNA上的互補序列結合以抑制翻譯，從而沉默基因表達。研究表明，miRNAs可調節成癮行為，被濫用藥物改變的miRNAs已被證明可調節多種與成癮密切相關的蛋白質的表達[37]。如miR-124在伏隔核中的過度表達可以減少可卡因的條件位置偏好，而miR-181a的過度表達具有相反的效果[38]。這表明通過藥物誘導miRNA的調節也能作為耐受和不斷增加酒精攝入量的調節機制。

急性和慢性酒精暴露都會上調培養的紋狀體神經元中的miR-9，其可能是通過調節電壓依賴的鈣離子活化的鉀離子通道促進酒精耐受[39]。miR-9也會靶向作用于多巴胺D2受體，影響酒精的獎賞效應[40]。酒精暴露及戒斷后對幾個與成癮相關的miRNA進行新一代測序對于揭示特定miRNA的調控至關重要。

4 小 結

表觀遺傳學是神經科學新興的研究領域。目前的研究結果表明，杏仁核中組蛋白修飾引起的染色質重塑可能對急性和慢性酒精暴露有重要影響。DNA甲基化作為基因表達水平的關鍵調節機制，在酒精依賴中也發揮著重要作用。雖然一些研究結果提示HDAC抑制劑可能是治療酗酒的潛在藥物，然而不同類型的HDAC在酒精依賴過程中的特定作用以及酒精暴露對大腦中各種DNMT的調節尚不清楚。目前仍然存在諸多問題需要解決，如基因組序列中的個體差異如何與表觀遺傳調控中的個體差異相關聯；酒精誘導的表觀遺傳修飾發生在外周組織如血液中，這些變化是否屬于成癮相關現象；在成癮模型中的表觀遺傳調控是否存在性別差異。未來的研究將還需要更全面和詳細的酒精濫用及依賴調節表觀遺傳機制證據，以增加對酒精依賴整體基因組功能的理解。