細胞凋亡主要檢測方法及其應用

何玉婷，楊 雯，王改琴，張旭東※

(1.長治醫學院第一臨床學院2015級，山西 長治 046000； 2.長治醫學院組織學與胚胎學教研室，山西 長治 046000)

細胞凋亡現象最早由Lockshin等于1965年發現，然而直到1972年Kerr等[1]才初次提出細胞凋亡這一概念。細胞凋亡定義為細胞為維持其內環境的穩態，由基因控制的自主、有序而無炎癥性的消亡過程[2]。細胞凋亡過程是細胞主動死亡的過程，涉及基因的激活、表達和調控等事件，由基因嚴格控制[3]。細胞凋亡的異常會使細胞失去控制，與腫瘤的發生、先天性畸形形成以及神經系統疾病、心血管疾病、免疫系統疾病等疾病的發生發展關系密切[2,4]。細胞在凋亡過程中會出現一系列特征性變化，包括核固縮、核碎裂、凋亡小體形成等形態學變化以及DNA特征性片段化、新基因表達、某些生物大分子合成等生物化學變化[5]。細胞凋亡的檢測方法正是基于凋亡細胞特殊的形態學改變和生物化學變化而設計的。近年來，凋亡細胞的判斷和機制的產生等方面進展顯著，許多細胞凋亡檢測的方法得到更廣泛的應用。現就近年來細胞凋亡主要檢測方法的進展及其應用進行綜述，以期為相關研究領域的工作者提供參考與借鑒。

1 細胞凋亡的形態學檢測

細胞發生凋亡時會出現一系列獨特的形態學特征，如細胞體積變小；核固縮，核仁碎裂，染色質密度增高；胞質濃縮，細胞器密度增高；細胞膜皺褶、卷曲、內陷，并將胞質和DNA分割包裹形成凋亡小體[2,6]。細胞凋亡過程中，凋亡小體被吞噬細胞或鄰周細胞識別、吞噬或自然脫落，無溶酶體及細胞膜破裂現象，無細胞內含物外泄發生，周圍組織無炎癥反應，也無次級損傷[2,6]。借用光學顯微鏡、電子顯微鏡或熒光顯微鏡可不同程度、不同層次地觀測到形態學特征。李媛媛和吳洪娟[7]用雙氫青蒿素體外誘導人乳腺癌細胞凋亡，借助透射電子顯微鏡觀察到凋亡晚期細胞核膜間隙增大，核膜完整性被破壞；染色質高度濃縮、凝聚，呈半月形或團塊狀，且堆積在核膜內側緣或聚集于核中央部；線粒體腫脹，胞質內出現許多空泡和凋亡小體；細胞外可見大量細胞碎片。王宏剛等[8]用吖啶橙、Hoechst 33342等染色劑對DNA特異性染色，借助熒光顯微鏡、共聚焦激光顯微鏡清楚地觀察到染色質高度凝聚、邊緣化，細胞核裂解為碎塊等微細結構變化。細胞凋亡形態學檢測的方法因簡易、直觀和定位較好的優點至今仍被使用，但也有不足之處：對結果的判定缺乏特定標準，主觀性大，因人而異；不能滿足定量的要求；對大樣本的檢測耗時費力。由于形態學有較大局限性，因而多用于固定組織細胞檢測，常作為其他技術的基礎[2]。

2 細胞凋亡的DNA片段檢測

DNA斷裂是細胞凋亡最顯著的特點，細胞凋亡時，核酸內切酶將DNA切割為更小的片段，可通過檢測DNA片段來檢測細胞凋亡。常見的DNA片段檢測有瓊脂糖凝膠電泳法、原位末端標記法、酶聯免疫吸附試驗。

2.1瓊脂糖凝膠電泳法 瓊脂糖凝膠電泳法是利用具有網格結構的瓊脂糖凝膠作為“過濾器”，不同分子量和帶電量的核酸和蛋白質等生物結構通過時受到的阻力大小不同，遷移的速度也不同，因此可將其分離[9]。細胞發生凋亡時，Ca2+、Mg2+依賴型核酸內切酶與相關蛋白水解酶被激活，將DNA降解，形成長度為180～200 bp或其整倍數的DNA片段。生理情況下，活細胞DNA不斷裂，凝膠電泳為一正常條帶；壞死細胞的DNA隨機斷裂，凝膠電泳表現為彌漫連續模糊的條帶；而凋亡細胞的凝膠電泳一般形成等腰梯形條帶，這是凋亡具有代表性的重要的生化結果[2,10]。此法操作簡單，定性準確，但特異性和敏感性差，只能進行半定量，不可定位檢測，且不適于檢測細胞凋亡初期DNA鏈的輕微損傷。

2.2原位末端標記法 原位末端標記法包括DNA聚合酶或克列諾酶介導的原位缺口平移法以及末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)，能很好地檢測DNA的分步降解。①原位缺口平移法[11]：細胞凋亡時，DNA多聚酶表達外切酶活性，使核苷酸由5′端切向3′端，借助DNA多聚酶Ⅰ(或Klenow)，并用帶有標記的游離核苷酸從3′-OH末端連接到斷片上以修復DNA，可顯示出含有斷裂DNA的細胞，可用于細胞凋亡的觀察。②TUNEL[12-14]：其原理與原位缺口平移法相似，不同的是TUNEL所需的酶為末端脫氧核苷酸轉移酶，該酶修復單鏈或雙鏈的DNA過程中不需DNA模板，可直接催化3′端的核酸聚合反應，加入帶有熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素標記的核苷酸，發生顯色反應后可特異地進行原位凋亡細胞的檢測。正常或增殖細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而近乎沒有3′-OH 形成，故很少被染色。原位末端標記法對完整的凋亡細胞或凋亡小體進行原位檢測，能準確地反映細胞凋亡最典型的生化和形態特征，并可檢測出少量凋亡細胞，適用于冰凍切片、石蠟包埋組織切片，以及培養的或從組織中分離的凋亡細胞測定，其敏感性高、操作較簡便快捷，是目前應用于檢測細胞凋亡的熱門方法。需要注意的是，由于細胞壞死時胞內也產生DNA片段，只有廣泛的DNA鏈發生斷裂才能說明細胞發生凋亡；該法過程如果處理不恰當極易造成假陽性，且結果受實驗者主觀影響較大，必須設立陽性和陰性對照，且成本偏高，若與其他方法結合使用可顯示出更好的優越性。

2.3酶聯免疫吸附試驗 酶聯免疫吸附試驗是將已知的特異性抗原或抗體吸附在固相載體(如聚丙酰胺、纖維素或聚苯乙烯等)表面并保存其免疫活性，使酶標抗原或抗體有序地在固相表面進行反應的技術[15]。細胞發生凋亡時，DNA發生核小體間的斷裂，形成由DNA與組蛋白(包含H、H2A、H2B、H3、H4五組分)緊密結合的核小體單位的片段[2]。酶聯免疫吸附試驗采用雙抗體(抗組蛋白抗體和抗DNA抗體)夾心免疫法檢測細胞凋亡后形成的核小體，酶催化后形成有色產物，根據顏色反應的深淺定性定量分析細胞的凋亡情況[2]。此方法所需細胞數量少，敏感性高，凋亡早中晚期均可進行檢測，既可定性又可定量，且適合大批量樣本的檢測，無需特殊設備。缺點是因檢測對象是細胞質中的核小體，故細胞裂解的時長應嚴格控制，否則裂解細胞時間過長則細胞核中的DNA片段也被顯色，最終影響檢測結果的真實性[16]，另外，也不能進行細胞的組織學定位。

3 流式細胞術

流式細胞儀(flow cytometry，FCM)可對浮在液相中且分散著的生物細胞進行定性、定量分析與分選，不僅速度快、敏感性和精確度高，而且對于不同細胞發生凋亡進度不同的過程，FCM的檢測更準確[17]。FCM檢測的信號與酶聯免疫吸附試驗相似，只是用熒光代替了催化酶。FCM通過檢測熒光參數及光射特征來檢測細胞凋亡，檢測得到的并非單個細胞的凋亡情況，而是對所有加入的懸浮細胞進行凋亡情況統計。工作原理為當待檢測的細胞依次排列進入該儀器的液流系統、光學系統，經激光照射，被熒光標記了的細胞向空間各個方向散射光線，其中前向散射光(forward scatter，FSC)強度代表了細胞的大小，而側向散射光(side scatter，SSC)與細胞顆粒的復雜程度，即細胞內部細胞器及胞質的折射率有關。細胞凋亡時，細胞固縮，體積變小，細胞內顆粒往往增多，故凋亡細胞的FSC降低，SSC增高；相反，正常細胞的FSC增高，SSC降低；而壞死細胞的FSC和SSC同時增高[18]。因此，可區分正常、壞死和凋亡細胞。郭茜茜等[19]認為FCM適用于早、中期凋亡階段凋亡率的測定。但對于凋亡晚期，相關學者使用FCM的同時配合相關染色劑也得到了滿意結果[20]。需要注意的是，細胞胞質是否均一、核與胞質比率差異等均可使檢測結果不同，從而影響對凋亡細胞的判斷。

3.1細胞周期的測定 一個細胞周期可以人為地劃分為G1期、S期、G2期和M期，其中S期、M期為細胞增殖的關鍵時期，完成DNA的合成及細胞分裂。DNA含量隨這4個時期的變化而呈周期性變化[21]。線粒體介導的、膜受體介導的細胞凋亡均與細胞周期密切相關，總是發生在細胞周期的特定時相(如星形膠質細胞凋亡大多發生在G1期、G1期的阻留狀態即G0期)，細胞凋亡是細胞周期事件[22]。細胞凋亡后發生DNA斷裂，用碘化丙啶(propidine iodide，PI)、苯基吲哚、吖啶橙等染色劑標記DNA，通過FCM分析，可以得到細胞各時期的分布狀態，便可計算出G1、S、G2和M期各占多少，以判定細胞凋亡的程度和比率[23]。其缺點是受反應時間、溫度等影響，溢出DNA小片段的程度不同，會出現凋亡細胞與非凋亡細胞的重疊峰[14]。

3.2胱天蛋白酶(caspase)活性檢測 主要有4種蛋白分子家族參與細胞凋亡機制的發生，包括caspase家族、銜接蛋白、Bcl-2家族和凋亡抑制因子[24]。caspase家族在細胞凋亡的調節和執行中的作用十分關鍵，其中caspase-3被認為是各種因素導致凋亡的關鍵酶，生理狀態下它以酶原的形式存在，并不表現活性，其活化是細胞凋亡的必由之路，預示著細胞執行凋亡程序的開始，是凋亡進入不可逆階段的標志[25]。目前，壞死細胞中尚未發現有caspase-3的活化，因此，通過檢測caspase-3活力強弱可判斷細胞是否凋亡或壞死。檢測caspase-3活性方法較多，可借助免疫電泳法、免疫凝膠擴散法等分析caspase-3酶原加工的中間產物和底物水解后的最終產物，或用發色底物法(Trinder反應)合成底物檢測酶活力，或將活化的caspase-3還原，在還原體系中加入化學試劑生成顯色物質，通過比色法得出還原物質的量，進而計算酶的活性[17]。這些方法再結合FCM可定性和定量檢測凋亡細胞，且準確性好、敏感性高、特異性強，但是在凋亡晚期，caspase-3活性大幅下降，因此這種方法更適用于細胞凋亡的早期檢測。

3.3磷脂酸結合蛋白V(Annexin V)/PI雙染法對凋亡細胞的檢測 磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)又稱復合神經酸，位于正常細胞膜的胞質一側，在細胞凋亡早期，PS可從細胞膜胞質側翻轉到細胞膜外表面[26]。基于此現象，利用Ca2+依賴性Annexin V可與PS特異性結合，且親和力高，用Annexin V(熒光素或生物素標記)作為熒光探針，采用FCM或熒光顯微鏡進行檢測，此法敏感性較高，適用于細胞凋亡早中期。不足之處是壞死細胞的PS亦暴露于細胞膜外表與Annexin V結合，出現假陽性，干擾檢測結果的準確性。PI為一種核酸染色劑，與細胞核結合將細胞核染為紅色。PI不可透過正常的細胞膜，可透過凋亡中晚期以及壞死細胞的細胞膜，適用于在排除細胞壞死的前提下細胞凋亡中晚期檢測[27]。將Annexin V與PI同時使用，借助FCM分析Annexin V和PI的示色情況，其中Annexin V-/PI-、Annexin V+/PI+、Annexin V+/PI-、Annexin V-/PI+分別表示正常、壞死、凋亡和機械性損傷的細胞[28-29]。該方法的特點是細胞分群明顯，結果靈敏，但是為防止造成細胞膜損傷，操作要求嚴格，費用昂貴。

4 線粒體膜電位變化的檢測

線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)是指線粒體內膜兩側質子分布不均一而形成的電化學梯度。研究表明，細胞凋亡時，線粒體膜孔道大小及膜電位會發生改變，許多刺激因子可通過線粒體誘導細胞發生凋亡。凋亡早期的細胞，線粒體鏡下還未出現顯著變化時，實際上其膜電位已經開始改變：膜通透性增加，跨膜電位下降[30-31]。因此Δψm下降被認為是凋亡最早的步驟，如果Δψm被破壞，則細胞凋亡不可逆轉[31]。一些親脂陽離子熒光染料，如羅丹明123、JC-1、DiOC6(3)等可與線粒體基質緊密結合，細胞聚集染料能力的下降程度與膜電位的下降程度呈正相關[32]。細胞凋亡時，線粒體內膜負電位絕對值減小，熒光強度降低，借助FCM以及熒光顯微鏡均可精確地檢測出線粒體跨膜電位的變化情況，可判斷細胞凋亡的發生。岳磊等[17]用紫外線照射HeLa細胞后，經羅丹明123染色，熒光強度減弱，Δψm明顯下降，認為結合FCM可快速的定性、定量分析凋亡細胞。需要注意的是，Δψm變化的檢測屬于電化學方法，pH值的改變會影響細胞膜電位變化，在應用時需保持平衡染液pH值前后一致。

5 細胞凋亡相關基因及其產物的檢測

細胞凋亡是在基因調控下的細胞自我消亡過程。細胞凋亡時某些基因表達異常產物，這些基因轉錄翻譯出來的產物可促進或抑制細胞凋亡，如細胞凋亡蛋白家族、凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)及Fas(Apo-1，CD95)等。線粒體在細胞凋亡的過程中起中心調控的重要作用，病理狀態下，其結構破壞以及功能紊亂與細胞凋亡有不可分割的關系[33]。Bcl-2、Bax、Bad、Bak組成的細胞凋亡蛋白家族主要作用在線粒體膜上，其中調控因子Bcl-2和Bcl-xl具有減緩細胞異常凋亡的作用；而Bax、Bad與Bak可加快細胞的凋亡[34]。Apaf-1是誘導細胞凋亡的腫瘤抑制基因，Apaf-1和caspase-9酶原(procaspase-9)與細胞色素C結合后形成的凋亡體可激活procaspase-9，引起caspase(如caspase-3等)一系列反應，從而引發細胞發生凋亡[35]。Apaf-1是C-myc癌基因誘導細胞凋亡的相關因子，參與線粒體途徑的凋亡[36]。Fas是一種膜蛋白受體分子，多數分布于細胞表面，少數存在于血液系統。Fas與Fas抗體/配體結合后，促使細胞凋亡[37]。這些相關基因及其表達產物的測定可為細胞凋亡檢測提供依據。

6 細胞凋亡的細胞色素C檢測

細胞色素C是一種信號蛋白質，生理情況下存在于線粒體內外膜之間，不能自由通過線粒體的外膜。接收到凋亡信號后，細胞色素C可從膜間隙轉移至胞質中，在ATP作用下特異地與Apaf-1緊密結合，啟動一系列caspase級聯反應，從而引發細胞凋亡[35]。蛋白印跡法(Western Blot)是將蛋白質轉移到膜上，再利用抗體進行檢測的方法。細胞色素C作為蛋白質，可用相應抗體作為一抗進行檢測，再進行化學發光反應，從而判斷凋亡的發生[38]。

7 細胞凋亡的Ca2+濃度變化測定

細胞的生命活動都離不開Ca2+，Ca2+超載時，心肌細胞的線粒體通透性轉換孔開放，細胞色素C等凋亡因子通過線粒體通透性轉換孔釋放或使線粒體膨脹破裂進入胞質，活化細胞色素C依賴的細胞凋亡通路后激活caspase-3，導致細胞凋亡[39-41]。細胞內外Ca2+平衡與細胞凋亡密切相關，細胞內Ca2+穩態主要是通過內質網來維持的，當平衡被破壞后可引起細胞凋亡[42]。用Ca2+特異性熒光探針，如Rhod-2、Indo-1等對細胞進行標記后，再用FCM或熒光、共聚焦激光顯微鏡檢測。這種方法可以準確地得出細胞凋亡的生理免疫指標，且實驗數據說明性較強。

8 小 結

細胞凋亡是一個步驟繁多的過程，在基礎實驗以及臨床診斷中，細胞凋亡的檢測占有非常重要的地位。細胞凋亡的檢測方法較多，以上均是主要而常用的檢測方法，還有一些檢測方法，如端粒酶的檢測、mRNA水平的檢測、乙酰膽堿酯酶的檢測及微流體技術等沒有列入。每種方法均有其各自的優缺點，在實際應用中，應針對不同凋亡階段的細胞采用多種檢測方法相結合，這樣才可以觀察到實驗細胞真實準確的凋亡結果，從而對該結果進一步深入分析得出相應結論。相信隨著科學技術的不斷發展以及人類對細胞凋亡機制的探索進一步深入，會出現更多準確性高、特異性強、耗時和耗費少的檢測細胞凋亡的新方法。