3D打印脫細胞外基質支架修復軟骨缺損的研究進展

王議峰，李松軍

(遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院骨一科，廣東 珠海 519100)

關節軟骨缺乏營養供應，損傷后自我修復能力差[1]，從而導致長期的關節疼痛和功能障礙，甚至關節廢用，給患者帶來極大的痛苦和不便。傳統的軟骨修復方法，如微骨折術、軟骨下鉆孔術、骨膜移植等，修復的是纖維軟骨，在組織學上纖維軟骨與周圍正常軟骨不同[2]，導致療效不佳。近年來，對制備組織工程支架所需的3D 打印材料——生物油墨研究較多，利用該材料制備的3D支架與軟骨缺損部位解剖外形吻合，同時具有細胞黏附、增殖所需三維結構以及支架材料所必需的機械強度，這給軟骨損傷及缺損的修復帶來了希望。目前，3D打印材料種類繁多，選擇合適的材料作為生物油墨是3D生物打印成功的關鍵一步[3]。迄今為止，以天然生物聚合物為基礎的水凝膠，如海藻酸鹽[4]、明膠[4]、膠原蛋白[5]、纖維蛋白[5]、透明質酸[6]和殼聚糖[7]等，已被證明具有生物油墨的一些基本特性。這些生物油墨不僅可以作為3D支架的基礎，還可以維持和促進細胞的活性。盡管如此，在固有細胞外基質(extracellular matrix,ECM)中模仿錯綜復雜的結構仍然存在困難[8-9]。此外，每個組織都有固有的ECM組成結構，使得理想的ECM擬態的構建可能超出任何組織工程技術的制造能力[10]。脫細胞外基質(decellularized extracellular matrix, DECM)被認為是最有前途的替代材料之一。現總結DECM支架修復軟骨缺損的研究現狀，并總結在研究和應用中所遇到的問題及發展方向。

1 DECM支架修復軟骨缺損的機制

1.1促進軟骨細胞黏附增殖 DECM具有良好的組織相容性，細胞可通過自身表面抗原與其結合，從而提高了細胞的黏附性。Kang等[11]運用人關節軟骨DECM構建3D支架，這種支架可以支持間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)的細胞黏附與增殖。而目前有研究證實，與純聚合物相比，DECM的天然蛋白質或多糖與合成聚合物的組合使磷酸化黏著斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase, pFAK)表達增加，從而增強細胞黏附和增殖[12]。其主要機制為:pFAK通常用作細胞/材料相互作用的重要生物標志物，它通過細胞信號通路對細胞周期、黏附增殖進行調控。細胞信號通路常在細胞-ECM相互作用下被觸發，使細胞生長因子上調，然后通過在黏著斑點處直接結合整合素β1的細胞質結構域來激活FAK。研究發現FAK是整合素信號轉導的重要介質，這種整合素介導的細胞黏附促進了FAK的自身磷酸化[13]。之后，pFAK調節局灶性接觸，形成細胞擴散和誘導細胞運動所必需的信號通路[14]。據報道，pFAK還可進一步激活細胞外信號調節激酶，從而增強細胞增殖[15]。鑒曉東等[16]運用羥基丁酸-羥基辛酸共聚體(poly hydroxybutyrate-co-hydroxyoctanoate,PHBHOx)/DECM構建組織工程支架，并進行細胞-支架培養，24 h后進行細胞黏附率測定，發現實驗組支架的細胞黏附率及細胞增殖數量明顯高于對照組，并且隨著PHBHOx與DECM復合比例的變化，支架的細胞黏附率及細胞增殖數量也隨之變化。Shakouri-Motlagh等[17]發現，與在TCP上擴增的MSC相比，在DECM上擴增的MSC數量顯著增加。DECM因自身結構能夠促進細胞黏附增殖，與其他支架材料構建的復合物增強了細胞增殖與黏附的效果，這為通過組織工程支架搭載多能分化細胞進行軟骨缺損修復提供了理論基礎。

1.2促進干細胞定向分化 能夠促進細胞增殖、分化是理想的組織工程支架的基本條件之一。近年來，DECM作為生物油墨構建3D支架，受到廣泛關注。DECM與ECM結構及組成相似，而組織器官的機械強度部分依賴于ECM,因此，不同強度對ECM的機械刺激，可影響細胞行為。研究顯示，MSC可以識別基質的硬度，并根據基質硬度分化成不同的譜系[18]。同時，ECM可以下調可溶性因子的活性。其蛋白多糖可以與骨形態發生蛋白的抑制劑腱蛋白結合，抑制骨形態發生蛋白信號通路[19]。此外，ECM蛋白本身也可以通過與細胞黏附分子如整合素[13]的相互作用，激活細胞內的信號轉導，從而激活細胞內信號，調控細胞存活、增殖、形態發生遷移和分化等多種細胞功能[15,20]。

干細胞是組織工程和再生醫學中很有前景的細胞來源。在干細胞分化過程中，轉錄因子的表達受細胞外微環境信號(如可溶性因子和ECM)的調控，研究者可以根據DECM促進干細胞定向分化的特性進行研究。Jang等[21]通過3D打印技術構建DECM補片進行心臟修復研究，發現DECM補片能夠促進其中的心臟干細胞/MSC定向分化為新生血管以及促進心肌重塑。此外，軟骨修復研究發現，軟骨DECM能夠為細胞提供三維環境，適合于MSC的附著、增殖和軟骨分化[22-23]。Mao等[24]在對DECM支架的實驗研究中也發現，DECM能夠誘導和促進MSC定向分化為軟骨細胞。同時，他們對于不同組織的ECM進行細胞培養，結果顯示，來自軟骨細胞的ECM促進了MSCs的軟骨分化，來自成骨細胞的ECM促進了MSCs的成骨分化。這些研究表明，DECM能夠促進干細胞分化，但不同組織來源的DECM在組成上具有特異性，因而可以誘導干細胞向不同組織和功能的細胞分化。

1.3低異物反應 異物反應是支架材料修復軟骨缺損的影響因素。支架材料植入機體后，其表面抗原與機體抗體結合，促進生長因子、趨化因子及細胞因子等聚集，募集固有免疫細胞(如中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞)到損傷部位，形成肉芽腫，并逐漸形成瘢痕組織，最終完成損傷修復[25]。異物反應不可避免，但過度的異物反應會延遲組織愈合，增加瘢痕形成。特別是對于軟骨組織，過度異物反應，瘢痕組織增加，不利于關節軟骨修復，并影響關節功能。支架材料植入體內后引起的炎癥反應與植入材料的類型有關[25]，因此有關支架材料的研究希望改變或控制上述因素，從而降低異物反應，達到組織修復的目的。DECM屬于天然生物油墨，在此方面優勢明顯。研究顯示，組織進行脫細胞處理后，移除了可能引起機體炎癥反應或免疫介導的植入物排斥反應的潛在抗原[20]。這在臨床試驗中也得到證實，有研究者成功地將一個脫細胞的人供體氣管移植入1例患有終末期支氣管軟化癥的30歲女性體內。該患者未接受免疫抑制治療，移植3個月后無異物反應[26]。

2 DECM的生物力學特性

一個好的軟骨支架，不僅能為細胞提供良好生長環境，還要具備良好的生物力學性能。然而DECM材料作為3D打印制備組織工程支架還有很多不足，主要是打印出來DECM支架通常沒有足夠的機械性能[27]。有研究者用DECM支架修復關節軟骨缺損，對脫細胞基質支架進行生物力學檢測，結果顯示其剛度明顯小于正常軟骨組織[28]。另一研究從脂肪組織提取DECM打印組織工程支架，并在體內成功進行軟組織修復。但是DECM的溶解使其失去了原有的結構和機械強度[29]。因此，為了提高油墨的印刷性和組織功能，需要一種方法來調整DECM生物油墨的機械性能，目前主要通過改善DECM支架制備技術和支架材料的構成提高其機械性能。

2.1聚合物/DECM支架 用于構建DECM復合支架的聚合物主要分為糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)、絲素蛋白等天然高分子聚合物及聚己內酯(polycaprolactone, PCL)、聚乙烯醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)、PHBHOx等非天然高分子聚合物，它們具有良好的生物相容性和良好的機械性能，可彌補DECM支架機械性能不足的缺陷。Beachley等[30]用硫酸軟骨素-N-羥基琥珀酰亞氨基琥珀酸酯對GAG進行修飾后制備GAGs/GAG支架，其機械性能明顯增加。用絲素蛋白結合DECM制備的復合取向支架也顯示出良好的力學性能，且成分與天然軟骨相似，可以滿足天然軟骨對支架結構的需求[31-32]。同樣，PHBHOx[16]、PCL[33]、聚乙烯醇[34]、PLGA[35]與DECM制備的復合支架不僅能夠促進細胞黏附、增殖，同時機械性能較單純的DECM支架明顯提高，且隨著復合支架中高分子聚合物比例增加，機械性能也明顯提高。但有研究顯示，非天然高分子聚合物(如PCL)降解周期長(> 2年)，可能對機體造成不良影響[33]。

2.2MSC/DECM支架 MSC是當前組織工程領域的研究熱點，在軟骨缺損修復方面，常用的干細胞為骨髓來源MSC和脂肪來源MSC。其主要優點為：①來源廣泛，MSC存在于骨髓、脂肪組織、胎盤組織、牙髓、外周血及滑膜等組織中；②分離簡單、培養成功率高；③具有成骨、成軟骨、成脂肪細胞等多項分化潛能；④能夠分泌多種細胞因子，參與免疫反應，具有免疫抑制特性。因此，MSC在軟骨修復方面潛力巨大。有研究證實[11,36]，軟骨DECM支架可以促進骨髓來源MSC或脂肪來源MSC分化為透明軟骨，且機械性能明顯提高。

2.3DECM支架制備技術改進 當前3D打印技術(如噴墨打印)構建的DECM支架不能滿足軟骨所需的生物力學性能，因此研究者對打印技術進行改進。下面列舉兩種支架制備技術。

2.3.1基于數字光處理的快速3D生物打印 數字光處理快速3D打印技術在醫學領域研究較少。Ma等[37]開發出數字光處理的快速3D生物打印方法，并運用于肝臟DECM支架的構建，結果顯示，肝臟DECM的支架不僅支持細胞活力，還提供穩定的生理學相關的機械環境。其主要優點為：①實現了生理相關幾何形狀的靈活設計以及對支架機械性能的精確控制；②通過改變曝光時間，可以在不改變支架組分的情況下易于控制剛度變化，從而消除由材料濃度或化學組成不同對細胞行為產生的影響。這種3D打印技術在組織工程支架制造技術中顯示出了一定的優勢，但該技術在軟骨修復方面的研究還未見報道。

2.3.2冷凍干燥技術/3D打印 冷凍干燥技術和3D打印技術結合，能夠精確構建宏觀結構和微觀結構相結合的組織工程支架，從而提高生物力學性能。Xu等[38]通過定向冷凍技術制備的DECM支架，不僅能夠促進細胞生長和軟骨再生，還具有定向顯微結構和高力學性能。但是不同材料打印時所需參數不同，增加了打印難度與成本。

3 DECM支架材料在軟骨缺損處的固定

支架固定是組織再生的關鍵步驟，但有關支架固定的報道較少。組織工程支架在軟骨缺損處如何實現生物固定、功能整合，以及如何防止其在軟骨缺損處移動，都是需要解決的問題。傳統的方法主要為縫合固定和壓合固定，但這些方法會造成固定困難、移位、手術時間長等問題。另外，多處縫合會導致軟骨骨折或支架損壞，術后可能導致植入物降解、吸收[39]。針固定和銷釘固定已被提出替代傳統縫合方法[40-41]，與傳統縫合技術相比，它們的極限失效載荷、屈服載荷和剛度顯著提高[40]。但是，由于針固定和銷釘固定技術對支架材料的生物力學性能要求較高，因此，這種固定技術不能使力學性能較低的支架在軟骨缺損處得到有效固定。D?ner[39]提出以2-氰基丙烯酸丁酯為軟骨黏結劑，以促進基質植入，這種固定方式具有結合緊密、容易固定軟骨移植物的特點，同時2-氰基丙烯酸丁酯具有生物降解特性，但目前臨床上尚未推廣。也有研究表明，生物相容性膠粘劑與壓合技術相比并不能改善支架的固定[42-43]。有研究者制備了脫細胞軟骨源性基質支架與磷酸鈣基的復合支架，脫細胞軟骨源性基質支架可以作為骨軟骨插頭,結合插入壓合的方式,使支架復合物固定于軟骨缺損基地部，避免了不安全的或復雜的固定技術引起的周圍組織損傷[28]。隨著跨學科研究的興起，一種基于磁場力，將支架牢牢固定在植入位置的方法已經產生[44-45]。該方法通過磁力達到有效的支架固定，操作簡單。但還有許多問題需要研究，如磁性材料，是否具有生物相容性、降解性，以及植入機體后的安全性問題等。

4 問題及展望

3D打印技術的發展，為軟骨缺損修復帶來了新希望，它可以根據受損部位的三維結構，設計出個性化組織工程支架。同時隨著生物油墨材料的不斷發展以及制備技術的改進，軟骨缺損修復具有巨大發展前景。脫細胞基質材料作為生物油墨構建軟骨支架，具備很大的潛力。它來源于自體組織，具備良好的細胞黏附、增殖及定向分化能力，同時生物安全性高，能夠實現內在的細胞形態學和功能重建。但DECM機械性能差，不能滿足關節軟骨所必需的機械強度。雖然脫細胞基質與其他材料復合(如PLGA)構建的支架材料機械性能提高，但還存在一些較難解決的問題，如加大了材料的硬度，其韌性就會下降。對于支架復合物，如何能夠在軟骨缺損處可靠固定以及固定方式、固定材料的選擇也是目前軟骨修復方面需要進一步研究的課題。