微管正端示蹤蛋白與神經系統疾病

宋彬彬 王玉波 賈炳泉 于 佳

微管是真核細胞中普遍存在的纖維網狀結構，散布于胞質中，參與細胞支撐、細胞遷移、細胞分裂、胞內運輸等過程，對于維持細胞結構和功能具有重要作用。微管是由13條原纖維(protofilaments)構成的直徑約22～25nm的中空管狀結構，每條原纖維由α-和β-微管蛋白(tubulin)頭尾相連形成的二聚體線性排列而成。且tubulin二聚體排列具有極性，使微管也具有極性，分為負端和正端：負端集中于近核區的微管組織中心(MT-organizing center，MTOC)，最末端為α-tubulin，聚合速度慢，較穩定；正端向外延伸，最末端為β-tubulin，聚合速度快，處于動態的聚合和解聚轉換狀態，即微管正端的動態不穩定性(dynamic instability)，使微管正端快速伸長或收縮，調節微管形態[1]。多種與微管結合的蛋白可特異性定位于微管正端，為微管正端示蹤蛋白(plus-end tracking proteins，+TIPs)，+TIPs可形成復雜的相互作用網絡，調節微管的結構和功能。神經元體積較大，軸突和樹突分支較多且長，因此更為依賴微管。+TIPs突變或表達水平變化與肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)和無腦回畸形(lissencephaly)等多種神經系統疾病相關。本文就多種+TIPs的結構、功能，及其相關神經系統疾病進行綜述。

一、微管正端示蹤蛋白結構和功能

神經元中+TIP種類較多，目前可分為兩大類：微管末端結合蛋白(end-binding proteins，EBs)依賴性+TIPs(EBs-dependent +TIPs)以及EBs非依賴+TIPs(EBs-independent +TIPs)。

1.微管末端結合蛋白(end-binding proteins，EBs):是+TIPs中含量最多的蛋白，自主定位于微管正端，并可與其他+TIPs相結合。哺乳動物中EBs蛋白主要有EB1、EB2和EB3，三者都可與微管正端結合，但與微管以及+TIP的親和力不同，EB1和EB3高于EB2。EBs 蛋白N端的CH(calponin homology)結構域具有MT親和能力，介導與微管正端的結合；C端的卷曲螺旋結構域(coiled-coil doamin，CCD)負責EBs單體的二聚化；保守的EB同源結構域(end binding homology domain，EBH)與CCD部分重疊；C端最末為高度保守的EEY/F序列。EBs主要作為微管正端的支架蛋白(scaffolding proteins)位于+TIP的中心，結合在微管正端的EBs可與胞質快速交流，為蛋白質快速結合提供平臺，有效形成和維持微管正端的完整性和功能，對于神經元結構和功能有重要作用。EBs可識別微管正端最末端蛋白，促進GTP水解，調節蛋白結構轉換和微管動力學[2]。Komarova等[3]研究發現體外培養的CHO-K1細胞中EB1和EB3可抑制微管崩解，促進微管持續增長。

2.微管末端結合蛋白依賴性微管正端示蹤蛋白:根據+TIP與EBs結合方式，其可被分為兩大類，一類是具有高度保守CAP- Gly結構域(cytoskeletal-associated protein glycine-rich domain)的+TIPs，可以與EB和微管蛋白羧基端的EEY/F修飾相結合。二類是具有SxIP基序(serine/threonine-any amino acid-isoleucine/leucine-proline motif)的+TIPs，種類較多，SxIP基序可以與EBs的EBH結構域結合。

(1)CAP-Gly結構域蛋白:細胞質連接蛋白(cytoplasmic linker protein，CLIPs)主要包括CLIP170和CLIP115，富集于軸突生長錐，調節微管穩定性和軸突的形成，其中CLIP170可與肌動蛋白actin結合蛋白IQGAP1協同作用調節樹突的形態，是重要的細胞極性調節因子。CLIP170的N端具有CAP-Gly結構域，可以與EB1和α-tubulin的C端EEY/F 修飾結合；C端具有兩個鋅結合域(zinc-binding domains)和EEY/F修飾，可與具有CAP-Gly結構域的+TIPs相結合。CLIP115與CLIP170的N端相似，但缺失CLIP170的C端結構域及功能。Komarova等[4]研究發現CHO-K1細胞中微管正端CLIPs表達水平下降引起動力蛋白激活蛋白dynactin最大亞基p150glued在微管正端定位減少，微管修復(rescue)速率顯著下降，微管壽命變短。

p150glued是由DCTN1基因編碼的，定位于微管正端。p150glued的N端具有CAP-Gly結構域，可與含有EEY/F序列的微管蛋白α-tubulin以及EB1和CLIP170直接結合；C端的CC1結構域可與動力蛋白dynein的中鏈(intermediate chain，IH)結合。其中p150glued CAP-Gly結構域與微管直接結合力較弱，EB1、CLIP170和p150glued相互作用可以增強p150glued在微管正端的定位，抑制微管正端崩解(microtubule catastrophe)。本研究發現9月齡p150glued微管結合功能缺失小鼠模型的脊髓組織中乙酰化α-tubulin水平增加，提示p150glued可調節微管穩定性變化[5]。

(2)包含SxIP基序蛋白:細胞質連接蛋白(cytoplasmic linker protein-associated proteins)具有CLASP1和CLASP2兩個亞型。CLASP1廣泛表達，CLASP2主要表達于神經系統。CLASPs不僅可與CLIPs結合，其具有SxIP基序可以與EB1結合；具有3個TOG(tumor overexpressed gene)樣(TOG1/TOG2/TOG3)結構域可以捕獲動態的微管末端。研究發現，CLASP2的TOG2結構域與微管正端結合后可促進微管重建，抑制崩解。敲減CLASPs的MDA-MB-231細胞中過表達EB3可增加微管解聚藥物秋水仙素(colchicine)誘導的微管正端崩解的頻率；過表達TOG2可抑制崩解[6]。

血影斑蛋白(spectraplakins)家族包含微管微絲交聯因子(microtubule-actin crosslinking factor proteins 1/2，MACF1/2)是一種細胞骨架交聯蛋白，可與中間纖維、肌動蛋白(actin)相互作用，調節胚胎發育、細胞遷移和極化。spectraplakins蛋白 C端GAR結構域(growth arrest-specific 2 protein-related region)和SxIP基序可與微管結合。研究發現，小鼠和果蠅神經元中spectraplakins水平下降使微管不能成束，軸突變短。小鼠腦發育過程中，敲減MACF1可使乙酰化微管蛋白水平下降，動態微管聚合解聚增強。抑制皮質椎體神經元遷移，引起神經元定位異常[7]。

p140Cap(cas-associated protein)是重要的接頭蛋白，對于細胞的黏附和生長具有重要作用。p140Cap具有SxIP基序，可與定位于微管正端的蛋白EBs相結合。研究發現，海馬神經元中p140Cap與EB3相互作用可以調節微管以及樹突棘的數量和形態，敲減p140Cap可破壞其與EBs間作用，影響微管和微絲細胞骨架結構，使樹突棘數量明顯下降，偽足增加[8]。

tau微管蛋白激酶(tau-tubulin kinase 1/2，TTBK1/2)屬于酪蛋白激酶1(casein kinase1，CK1)家族，二者具有高度同源的催化結構域和SxIP基序，非催化結構域存在差異。TTBK1特異性表達于中樞神經系統，參與tau的磷酸化和積聚，其主要使tau Ser422位點磷酸化，并且可激活細胞周期蛋白依賴激酶5 (cycline-dependent kinase 5，CDK5)等，調節信號通路，影響微管穩定性[9]。TTBK2廣泛表達，可磷酸化tau Ser208和Ser210等位點。且TTBK2以EB1/3依賴方式促使微管解聚蛋白KIF2A的S135位點磷酸化，抑制微管的解聚，而TTBK2缺失可阻礙微管的重建[10]。

在教學設計與評價上的主要特點 教學設計從普通的到信息化教學設計，教學評價從單一的、統一的到多元的、有針對性的評價。信息化教學設計涉及翻轉課堂和微課程的教學設計，以及其他信息化教學手段的教學設計；而教學評價在傳統的考試基礎上增加了檔案袋評價、概念圖評價、項目評價以及在線考試等方式。

皮層蛋白結合蛋白2(CTTNBP2)為神經元特異性F-actin調節蛋白，具有SxIP基序可與EB結合定位在微管正端。神經元發育過程中，CTTNBP2 的N端雙螺旋結構域(coiled-coil motifs，NCC)可調節CTTNBP2 寡聚體的形成；CTTNBP2中間結構域(middle region，Mid region)可與微管相互作用，并通過CTTNBP2寡聚體誘導微管成束，從而調節微管穩定性和樹突脊的形成[11]。

結腸腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)為微管正端支架蛋白，主要位于大腦皮質，其C端具有SxIP基序，使其聚集于微管正端。APC為RNA結合蛋白，可調節β2B-tubulin mRNA的表達，促進tubulin合成。β2B-tubulin主要定位于生長錐的微管動態區， APC與β2B-tubulin mRNA的結合受損可引起微管結構異常和細胞遷移障礙[12]。

3.微管末端結合蛋白非依賴性微管正端示蹤蛋白：lissencephaly-1(LIS1)蛋白高度保守，N端具有雙螺旋結構域(coiled-coil domain，CCD)調節二聚體的形成；C端具有7個WD40重復序列，可與tubulin、dynein/dynactin和CLIP170相互結合，調節微管動力學，抑制微管正端的崩解。LIS1參與調控神經祖細胞的分裂、神經細胞的遷移、突觸的形成和胞內軸突運輸等過程，對于腦的發育具有重要作用。LIS1缺失的純合小鼠胚胎期死亡，LIS1缺失NIH3T3細胞中微管結構受損[13]。體外培養雞E10～E13胚胎期感覺神經元，加入適量laminin后，dynein和tubulin快速到生長錐，微管正端的dynein可招募dynactin和LIS1，促進軸突延伸；抑制LIS1或dynein功能使微管不能成束，阻礙軸突延伸。海馬神經元中，LIS1、dynein和dynactin富集于生長錐，沉默LIS1的表達使微管散亂分布，干擾生長錐形成、軸突延伸以及突觸形成[14]。

kinesin4家族蛋白kinesin21A由驅動結構域、桿部雙螺旋結構域以及尾部WD40重復序列組成。WD40重復序列可與+TIPs相互作用使kinesin21A定位在微管正端，kinesin21A也可與微管結合蛋白1b(microtubule-associated protein 1b，Map1b)相互作用，抑制微管生長和突變(catastrophes)[15]。

二、微管正端示蹤蛋白參與神經系統疾病的發生

微管是重要的神經元骨架，調節神經元發育、極化、信號轉導和胞內運輸等生理活動。微管正端示蹤蛋白對于神經退行性變和神經發育異常等神經系統疾病的發生、發展有重要作用。

1. 神經退行性疾病:肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是最常見的運動神經元病，患者皮質、腦干和脊髓的運動神經元特異性變性死亡，導致四肢、軀干、胸部等肌肉逐漸萎縮無力。ALS中5%～10%為家族性患者，DCTN1是其致病基因之一。研究發現，ALS患者中存在DCTN1 R1101K、T1249I、M571T和R785W等突變型，且DCTN1功能缺失的運動神經元中出現軸突運輸障礙、神經肌肉接頭去神經支配、微管穩定性和自噬異常等ALS病理表現，而DCTN1突變或缺失引起運動神經元特異性損傷可能是由于運動神經元體積較大，軸突較長，分支較多，對于細胞骨架和軸突運輸的改變更為敏感[5，16]。遠端型遺傳性運動神經病(distal hereditary motor neuropathy，dHMN)也屬于運動神經元病。dHMN 具有多種亞型，其中dHMN 7B型(distal hereditary motor neuropathy type 7B)是由DCTN1 G59S突變引起的[17]。

佩里綜合征(Perry syndrome)是一類伴發抑郁、體重減輕和肺換氣不足等癥狀的帕金森綜合征，患者黑質和藍斑部位的神經元大量變性死亡。研究發現，DCTN1是佩里綜合征的致病基因，與佩里綜合征相關的p150glued突變主要發生在其N端的CAP-Gly結構域。DCTN1G71A突變型佩里綜合征小鼠模型早期(6月齡)活動能力下降，晚期(16月齡)運動協調動能障礙[18]。目前為止，與佩里綜合征有關的DCTN1突變型為F52L、G67D、G71A/E/R、T72P、Q74P和Y78C。

阿爾茨海默病是癡呆的常見類型，主要累計海馬、大腦皮質和皮下組織，病理表現為tau高度磷酸化形成神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)，臨床表現為進行性記憶衰退、慢性認知功能障礙、語言和社交功能減退等。研究發現，TTBK1及其變體與AD發生相關。TTBK1是神經元特異性激酶，可以磷酸化tau的AD相關位點AD患者腦中TTBK1水平顯著提高，tau Ser422位點磷酸化增強[19]。TTBK1轉基因小鼠記憶障礙，腦中磷酸化NFTs積聚，海馬區CDK5和calpainⅠ活性增強，NMDA receptor types2B(NR2B)水平下降，這提示TTBK1可能通過調節CDK5和calpain的活性而與AD發生相關。

2.神經發育相關疾病:威廉斯綜合征(Williams syndrome)為神經發育障礙引起。威廉斯綜合征染色體異常區域包含CLIP115蛋白的編碼基因CYLN2。CLIP115敲減小鼠具有生長緩慢、大腦異常、海馬區功能障礙和運動協調缺陷等威廉斯綜合征癥狀。CLIP115缺失的小鼠成纖維細胞中微管增長率未發生明顯變化，但CLIP170和dynactin與微管正端結合顯著增多，可能改變胞內逆向軸突運輸。

常染色體隱性智力障礙(autosomal recessive intellectual disability，ARID)是指發育過程中出現智力功能明顯低于同齡水平及社會適應能力顯著減弱。Larti等[20]通過基因測序法研究發現伊朗一ARID患者家族中出現CLIP170的無義突變p.Q1010*；ARID患者的淋巴母細胞中CLIP1基因(CLIP170編碼基因)轉錄和蛋白水平下降；皮膚成纖維細胞中微管正端只發現野生型(未突變型)CLIP170，提示CLIP170缺陷可能引起ARID。

自閉癥/孤獨癥(autism)是廣泛性發育障礙的代表性疾病。研究發現自閉癥患者中存在CTTNBP2L1213V突變型及其內含子2中鳥苷酸突變為胸腺嘧啶。此外，研究發現APC功能缺失型突變與識別和自閉癥樣疾病(cognitive and autism-like disabilities)發生相關。條件性敲除前腦神經元中APC的小鼠模型學習和記憶功能障礙，伴隨重復行為增加，社會興趣減少等自閉癥表現，這可能是由于突觸結構和功能異常引起的[21]。

無腦回畸形(lissencephaly)一般是由妊娠期12～24周神經元遷移缺陷引起腦溝和腦回發育缺陷，病理表現為腦回完全消失，腦表面光滑，也稱光滑腦。臨床患者通常伴隨不同程度的精神、運動和智力障礙。LIS1缺失或突變是引起無腦回畸形主要原因之一。LIS1相關無腦回畸形包括isolated lissencephaly sequence(ILS)、皮質下帶異位癥(subcortical band heterotopia，SBH)和Miller-Dieker綜合征(Miller-Dieker syndrome，MDS)。Nataliya等研究811位無腦回畸形患者發現，81%具有基因突變，且LIS1基因突變最多，占40%。研究發現，無腦回畸形中LIS1主要可發生錯義突變(T 92C、A 446G等)、無義突變(C 265T、C 430T等)、移碼突變(154-155 ins A、162-163 ins A等)、剪切突變(c.569-10T > C、c.900+1G> A等)和部分缺失突變。

先天性眼外肌纖維化1型 (congenital fibrosis of the extraocular muscles type 1，CFEOM1)主要是由于軸突尋路缺陷 (axon pathfinding defects)引起動眼神經發育缺陷，使眼睛運動障礙。研究發現，CFEOM1患者中存在KIF21A突變型如R954W(約70%)、R954Q、E944Q和M356T等。KIF21A R954W knock-in小鼠模型的神經元發育過程中，動眼神經較細，分支異常，表現出動眼神經和運動神經元數量減少，上瞼提肌變小，去神經支配等CFEOM1表征。KIF21A突變使其與微管結合增強，可能通過功能獲得方式引發CFEOM1[22]。

3.神經肌肉系統疾病:MACF1缺陷與神經肌肉系統疾病相關。MACF1缺失的純合體小鼠胚胎期死亡。特異性抑制小鼠神經系統中MACF1的活性可使細胞遷移受損，大腦結構紊亂，小鼠出生24～36h后呼吸衰竭而死。

MACF2缺陷與遺傳性感覺自主神經病(hereditary sensory and autonomic neuropathy，HSANs)和肌張力障礙(dystonia)有關。HSANs是由遺傳因素引起的以周圍神經受損為主的疾病。患者刺痛、虛弱、感覺疼痛和冷熱能力降低，可致四肢末端反復發作性無痛性潰瘍，致步態不穩等。研究發現HSANs患者中存在MACF2突變，使其轉錄異常；MACF2敲減的小鼠模型神經異常、肌肉攣縮。肌張力障礙是由于肌肉收縮不協調引發的運動障礙綜合征。MACF2異常可引起肌張力障礙，MACF2缺失的小鼠模型感覺神經元變性，共濟失調，且感覺神經元中自噬小體積累，自噬溶酶體和受損線粒體數量增加，提示MACF2異常可能通過引起自噬障礙而導致疾病[23]。

三、展 望

微管為神經元的細胞骨架和軸突運輸軌道，對于維持神經元的生長和功能具有重要作用。+TIPs種類較多，作用復雜，可調節和維護微管的正常結構和功能，對于細胞遷移、神經元極化以及突觸形成和功能等具有重要作用，其表達異常參與多種神經系統疾病的發生。本課題組研究發現，微管正端示蹤蛋白的突變或功能缺失與運動神經元變性死亡緊密相關，其具體分子機制是進一步研究方向。隨著分子生物學和神經生物學等研究技術的發展，可深入研究+TIPs的生理功能及其參與神經系統疾病的病理基礎和分子機制，對于臨床疾病的防治提供一定的參考意義。