基因檢測在腫瘤免疫檢查點抑制劑應用中的研究進展

許成，劉朝奇，黃艷芳，白敦耀，羅潔麗

(1.武漢科技大學附屬武漢市普仁醫院藥學部，武漢 430081；2.三峽大學醫學院，宜昌 443002 )

免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint blockade，ICB)旨在通過抑制腫瘤微環境中免疫檢查點的負性調節作用，重新激活T細胞，恢復機體抗腫瘤免疫反應，從而達到識別和清除腫瘤的目的[1-2]。其獨特的臨床療效，使得癌癥治療的適應證不斷擴大，為腫瘤免疫治療開啟了新篇章。近年來，以細胞毒T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4) 和程序性死亡因子(programmed cell death protein-1，PD-1)及其配體(PD-ligand 1，PD-L1)為靶點的ICB在晚期癌癥患者中的臨床療效獲得肯定，美國食品藥品管理局(FDA)先后批準了6種相關單克隆抗體，包括CTLA-4抑制劑ipilimumab(Yervoy)；PD-1抑制劑nivolumab(Opdivo)和pembrolizumab(Keytruda)；PD-L1抑制劑atezolizumab(Tecentriq)、durvalumab(Imfinzi)和avelumab(Bavencio)，分別用于晚期黑色素瘤、非小細胞肺癌、膀胱上皮癌等惡性腫瘤的臨床治療。還有以LAG-3、TIM-3、VISTA等免疫檢查點為靶點的抑制劑在研究中[3]。目前，這種免疫治療尚不精準，只有少數癌癥患者能夠獲得良好的療效[4]。基因檢測技術的飛速發展以及腫瘤基因組學認識的不斷深入，將使得基因組學驅動的精準腫瘤免疫治療成為可能。通過對腫瘤進行基因檢測，為患者選擇合適的給藥方案提供遺傳學依據，能夠使免疫治療更加精準有效。筆者將以臨床療效確切的CTLA-4、PD-1/PD-L1抑制劑為例，探討基因檢測對腫瘤ICB治療的重要意義以及其應用。

1 基因檢測對ICB治療的意義

基于免疫組織化學法檢測腫瘤組織中PD-L1蛋白的表達，是最早被應用于篩選合適患者的方法。迄今為止的臨床數據顯示，PD-L1的表達與癌癥患者對于ICB的高應答率和無進展生存率有關，但PD-L1表達陰性的患者也可能獲得很好療效[5]。CARBOGNIN等[6]基于Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗中nivolumab、pembrolizumab或atezolizumab對癌癥患者的治療結果，系統地分析了腫瘤細胞PD-L1表達與患者療效的相關性，結果顯示PD-L1表達陽性的腫瘤對抑制劑有更高的應答率，但仍有19.9%(154/773例)PD-L1表達陰性癌癥患者表現出客觀的反應。因此需要腫瘤微環境免疫調節的更多信息指導合理用藥。

腫瘤細胞是由體細胞突變積累產生的，包括堿基替換、堿基插入和缺失、DNA斷裂和異常重組引起的重排以及DNA片段拷貝數的變化等[7]。在過去的十年中，基因檢測技術，尤其是下一代基因測序(next-generation sequencing，NGS)的革命性進步，以及分析工具的智能化，使得研究人員能夠更準確地描述癌癥的分類，預測癌癥患者的預后，選擇有效的癌癥治療方法和個性化的癌癥治療，尤其是癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)計劃的完成及“泛癌癥圖譜(pan-cancer atlas)”計劃的推進，使NGS在腫瘤診斷和治療方面的應用更為重要。NGS包括全基因組測序、全轉錄組測序、全外顯子測序和靶向測序等。NGS技術克服了Sanger測序局限性，它允許在一次試驗中對整個基因組進行系統分析，有助于識別腫瘤的分子特征，以及獲取腫瘤細胞的全基因組數據[8]。對這些數據的挖掘和分析將為臨床醫生提供有用的診斷和預后信息，成為腫瘤精準治療的有力手段。

2 基因檢測與ICB的治療

2.1免疫檢查點基因檢測 T細胞活化受CTLA-4、PD-1/PD-L1等負性信號通路調節，CTLA-4、PD-1、PD-L1基因的單核苷酸多態性與自身免疫性疾病以及癌癥的治療和預后密切相關[9-11]。藥物基因組學的研究發現藥物的療效與藥物靶點基因多態性的關系密切[12]。因此ICB的作用靶點CTLA-4、PD-1、PD-L1的基因多態性可能是ICB療效差異的遺傳因素。在黑色素瘤患者中，BREUNIS等[13]已經評估了7個CTLA-4單核苷酸多態性(rs 733618，rs 4553808，rs 11571317，rs 5742909，rs 231775，rs 3087243和rs 7565213)與ipilimumab反應，與臨床反應顯著相關的基因型為CTLA-4 rs4553808的G等位基因、rs11571327的T等位基因、rs231775的A等位基因位。在50例接受了nivolumab治療晚期非小細胞肺癌患者中，NOMIZO等[14]檢測了患者血漿中PD-L1基因單核苷酸多態性，分析發現PD-L1 rs4143815為C/C或C/G基因型的患者和rs2282055為G/G或G/T基因型的患者有較高的無進展生存率，而PD-L1 rs4143815為G/G基因型的患者和rs2282055為T/T基因型的患者均無治療效果，提示PD-L1 rs2282055和rs4143815的基因多態性與非小細胞肺癌患者的療效差異相關。因此通過單核苷酸多態性分析可以預測腫瘤患者對ICB治療的反應性，指導臨床醫生的藥物選擇和治療方案設計。

2.2腫瘤細胞的微衛星分析 微衛星是自身DNA中的一段簡單重復的核苷酸序列。DNA錯配修復(mismatch repair，MMR)功能異常造成微衛星序列發生的錯誤，稱為“微衛星不穩定性”(microsatellite instability，MSI)。MSI狀態可通過PCR或NGS技術檢測。腫瘤中DNA錯配修復缺陷(mismatch repair deficiency，dMMR)導致高頻率微衛星不穩定(microsatellite instability-high，MSI-H)表型。MSI-H會引起腫瘤細胞突變的積累，導致腫瘤的高突變負荷、新的腫瘤抗原表達、腫瘤浸潤淋巴細胞增加以及上調免疫檢查點蛋白表達水平，從而影響ICB治療效應[15-16]。近期的臨床試驗數據表明，具有MSI-H表型的腫瘤使用PD-1抑制劑治療的有效率高于其他類型的腫瘤。LE等[16]在一項評估PD-1抑制劑pembrolizumab療效的Ⅱ期臨床試驗中，將41例患者分為3組：11例dMMR結直腸癌，21例DNA錯配修復正常的結直腸癌，9例非結直腸癌的dMMR癌癥患者包括膽管癌、胃癌等，結果顯示dMMR結直腸癌患者和非結直腸癌患者客觀反應率分別為40%和71%，而DNA錯配修復正常腫瘤患者沒有出現反應，說明dMMR/MSI-H與pembrolizumab效果之間存在直接的相關性。nivolumab的Ⅱ期臨床試驗數據也顯示nivolumab對dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者有持久的療效和疾病控制，在74例轉移性結直腸癌患者中，23例(31.1%)取得研究人員評估的客觀反應，51例(69%)患者在12周或更長時間里出現疾病控制[17]。基于前期的臨床研究結果，FDA在2017年5月加速批準了PD-1抑制劑pembrolizumab(Keytruda)用于治療表型為MSI-H或dMMR的實體腫瘤；2017年7月加速批準了PD-1抑制劑nivolumab(Opdivo)用于治療具有MSI-H或dMMR表型的轉移性結直腸癌患者[18-19]。因此通過微衛星分析篩選的MSI-H表型腫瘤更能獲益于ICB的治療。

2.3腫瘤突變負荷檢測 腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)即腫瘤基因組中每兆堿基中突變的數目。使用全外顯子測序技術(whole exome sequencing，WES)能夠檢測腫瘤樣本中所有的體細胞突變[9]。高TMB的腫瘤具有產生更多腫瘤新抗原的潛力，從而激活免疫系統對腫瘤的識別和清除，提示高TMB能增強腫瘤對ICB治療的敏感性[20]。臨床試驗發現ICB對于黑色細胞瘤和非小細胞肺癌等帶來了顯著療效，而對于胰腺癌、前列腺癌療效甚微。進一步分析這些癌癥的突變負荷，發現對ICB治療有較高應答率的腫瘤具有高突變負荷，包括黑色素細胞瘤和非小細胞肺癌；相反，胰腺癌和前列腺癌等具有較低的突變負荷，提示TMB與ICB治療的應答率相關[21-22]。SNYDER等[23]應用WES技術分析了64例接受CTLA-4抗體治療患者的惡性黑色素瘤外顯子基因，提示高突變負荷與持續的臨床反應相關。RIZVI等[24]使用WES技術對患者進行了非小細胞肺癌的外顯子序列分析，同樣發現具有較高突變負荷的非小細胞肺癌患者接受PD-1抗體的治療有較高的客觀反應率和無進展生成率。另外，吸煙肺癌患者的突變負荷遠高于不吸煙肺癌患者[25]。因此，在PD-1抗體治療非小細胞肺癌患者中，觀察到吸煙患者的應答率更高[5]。2017年，FDA批準了基于NGS的癌癥體外診斷產品Foundation One CDx(F1CDx)，用于對腫瘤324個基因的遺傳變異以及基因組MSI、TMB的檢測分析，進一步肯定了MSI、TMB的應用價值。因此TMB對于ICB療效具有潛在的預測意義。

2.4腫瘤特異性抗原檢測 腫瘤特異性抗原(tumor specific antigens，TSAs)是由癌細胞的基因突變產生的，在正常細胞中不表達。由于這類抗原對腫瘤細胞具有高度的特異性，可使免疫細胞能夠區分癌變細胞和正常細胞，從而避免自身免疫風險，是腫瘤免疫治療的潛在靶點，近年來引起了廣泛的關注。有研究表明，TSA是ICB發揮治療效應的關鍵因素之一。VAN ALLEN等[26]對110例轉移性黑色素瘤患者進行了全外顯子測序，發現有大量新抗原的轉移性黑色素瘤腫瘤患者更有可能對CTLA-4抑制劑治療產生應答。GUBIN等[27]在小鼠MCA肉瘤模型中展示了接受PD-1或/和CTLA-4抑制劑治療的小鼠能介導TSA激活T細胞并導致腫瘤排斥反應。現在NGS技術能以前所未有的精確度和速度揭示單個腫瘤(突變體)的突變譜，但從非同義突變中篩選出腫瘤特異性突變依賴于專業的分析技術，因此，檢測腫瘤特異性抗原在臨床上的應用仍受到限制。

2.5人類白細胞抗原檢測 腫瘤抗原通過加工被呈遞到細胞表面才能被T細胞識別，這是ICB治療的前提基礎。腫瘤抗原需要與人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)相結合后才能提呈到細胞表面[1]，因此HLA在某些腫瘤表達下調或丟失，直接影響ICB的療效。INOUE等[28]對比了13例轉移性黑色素瘤患者接受nivolumab治療前后的免疫相關基因mRNA表達水平，發現在治療前，應答者的HLA-Ⅰ類的HLA-A基因mRNA表達水平顯著高于非應答者，說明HLA-A基因的高表達水平與nivolumab較好的臨床療效相關。CHOWELL等[29]通過對1500多例接受過ICB治療的癌癥患者的HLA-Ⅰ類基因型分析，發現HLA-Ⅰ基因雜合性越高的癌癥患者越有可能從ICB的治療中獲益。此外，有研究表明HLA-Ⅰ類抗原表達與ICB的耐藥性有密切關系。ZARETSKY等[30]應用全外顯子測序分析了4例轉移性黑色素瘤患者的活檢標本，發現對PD-1抗體的獲得性耐藥可通過JAK 1/2突變失活下調IFNγ信號通路；或通過B2M基因突變介導HLA-Ⅰ類抗原表達的缺失。GETTINGER[31]等在對ICB耐藥的肺癌患者以及B2M基因敲除的肺癌小鼠模型中觀察到B2M的獲得性純合子丟失，使得HLA-Ⅰ類表達缺乏，導致對ICB抵抗。因此應用基因檢測技術分析HLA的表達情況，可用于指導ICB治療。

3 結束語

基因檢測技術的發展以及其在臨床應用的拓展為ICB的精準治療帶來新的思路。針對每個腫瘤基因組進行的基因檢測分析，掌握影響ICB療效的相關基因信息，可為每個患者提供個性化的用藥策略。一些ICB治療的相關基因變化，包括免疫檢查點基因多態性、微衛星不穩定狀態、腫瘤突變負荷等在臨床試驗中已被證明對ICB臨床療效有一定的預測價值，但這些標志物的適用范圍、協同關系和應用標準還有待進一步明確。NGS已在大規模的腫瘤基因檢測中展現了巨大應用前景，在臨床試驗中通過對晚期癌癥患者進行基因組檢測，為患者提供合理的治療方案，但目前NGS的臨床推廣應用還存在若干問題，如成本效益、周轉時間和臨床結果解釋等。相信在未來的腫瘤治療中，隨著基因檢測技術在臨床應用中的進一步推廣，尤其是“泛癌癥圖譜”的研究進展，及其對各類腫瘤相關基因的挖掘，使得基于基因檢測實時監控抗腫瘤免疫的應用成為可能，將能更好指導ICB藥物的個體化精準治療。