長鏈非編碼RNA人母系表達基因3在腫瘤發生中作用的研究進展

丁佳寧，馬進原，朱全剛，

(1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院藥學研究室，上海 200437；2.上海市皮膚病醫院藥劑科，上海 200443)

人類基因組測序鑒定發現，在人類基因組的30億個堿基對中，僅有約2%的堿基對編碼蛋白質，即人類體細胞的180 000個轉錄本中，僅20 000個編碼蛋白質，其余則為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)[1-2]。非編碼RNA可分為管家RNA、短鏈非編碼RNA(sncRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等亞型。目前，14 880個lncRNA已被ENCORE項目所確定，許多的lncRNA有自身的啟動子，多存在于哺乳動物中，而越來越多的研究證明，lncRNA在細胞分化、遷移和凋亡中能夠發生分子交換，并通過改變基因表達模式使細胞狀態發生改變[3-4]。第一個lncRNA——lncRNAH19，由Brannan等發現[5]。lncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，不具備生物學功能，但越來越多的研究表明，其參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程。lncRNA表達或功能異常與人類疾病的發生密切相關，包括腫瘤[6]、1型糖尿病[7]、心血管疾病[8]和退行性神經疾病等[9]。研究亦證實lncRNA參與了多種腫瘤信號通路，如Notch、mTOR、NF-Kb和Wnt[10-11]。它們影響和調節著細胞周期及細胞的凋亡、增殖、侵襲和轉移，并參與了腫瘤的發生和發展。lncRNA可以是抑癌基因，也可以是致癌基因。如lncRNA GAS8-AS1過表達能抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖[12]，而沉默Linc00673可抑制肝癌細胞的增殖、浸潤和上皮間質轉化(EMT)[13]。2003年，Zhang等首次發現lncRNA MEG3是垂體瘤的一個潛在的腫瘤抑制因子，之后研究者又在其他腫瘤上對其進行了研究，使人母系表達基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)在腫瘤中的作用和機制得到了更好地闡明。本文總結了MEG3的功能及其在腫瘤發生中作用的研究進展。

1 lncRNA MEG3的功能

MEG3是一種母系印記基因編碼的lncRNAs，它是小鼠母系印記基因Gtl2的人類同系物，首次識別于小鼠12號染色體末端，長度為35 000的單拷貝印記基因，是首個被發現的有腫瘤抑制功能的長鏈非編碼RNA[14]。

母系表達基因MEG3與父系表達基因DLK1可構成DLK1-MEG3印記域，它們分別位于人染色體14q32.3和鼠染色體12。其轉錄缺乏明顯的開放閱讀框，位于蛋白編碼基因DLK1的100 000處，啟動子易發生差異甲基化，且轉錄方向與DLK1一致。此印記域包含兩個差異甲基化區域(DMRs)，分別是IG-DMR和MEG3-DMR。MEG3-DMR的甲基化模式取決于IG-DMR，表明它們之間存在等級相互作用和明顯的特性[15]。

MEG3在多數正常組織中均有表達，如在中樞神經系統、唾液腺、胰腺和腎臟上皮細胞的發育過程中表達水平較高，其在成年小鼠腎上腺、腦垂體和大腦中也有表達，然而在人類腫瘤(如非小細胞肺癌、胃癌、子宮頸癌等)中異常低表達或不表達[16]。過表達的MEG3能抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，說明MEG3可能是一個抑癌基因。研究表明其發揮抑癌作用與DNA甲基化、cAMP途徑[17]、p53基因表達[18]、Rb途徑[19]以及影響血管生成[20]有關。MEG3的表達受表觀遺傳調控，在多種腫瘤中發現CpG異常甲基化。此外，基因拷貝數缺失被認為是腫瘤發生的另一機制。MEG3缺失一方面能夠上調父系表達基因，另一方面可以下調其下游基因和抑癌基因miRNAs的表達水平，但這一觀點仍存在爭議[21]。

2 lncRNA MEG3與腫瘤

隨著MEG3在垂體瘤中的研究，使得其與腫瘤的關系逐漸受到關注。目前已有多篇研究分別報道了MEG3在非功能性垂體腺瘤[16,22-24]、腦膜癌[25]、肝癌[26]、肺癌[19]、胰腺神經內分泌瘤[27]和前列腺癌[26-28]等多個腫瘤中的作用。

2.1 MEG3與非功能性垂體腺瘤

Zhang等于2003年首次發現MEG3參與了腫瘤的發生。首先，他們克隆了一個cDNA，它是來自MEG3(一個未知功能的母系表達基因)的一個新型的轉錄本，并研究了MEG3 cDNA亞型MEG3a的分子克隆、表達水平以及抗增殖作用。為了確定腫瘤形成的發病機制，他們通過cDNA代表性差異分析法比較發現MEG3 cDNA片段在正常人垂體組織中表達較高，而在臨床非功能性垂體腺瘤中表達較低或缺失。之后通過Northern印跡雜交和RT-PCR進一步研究證實MEG3在非功能性垂體腺瘤和多種人癌細胞中都不表達。此外，研究還發現MEG3可通過異位表達抑制人癌細胞HeLa、MCF-7和H4的增殖。基因組分析表明MEG3位于染色體14q32.3位點，此位點已被報道存在抑癌基因，并參與了腦膜癌的發病機制。這些數據表明MEG3可能是一個新型的抑癌基因，它在人垂體腺瘤的發展中起重要作用[16]。

Cheunsuchon等對MEG3抑制垂體腺瘤增殖的機制做了更深入的研究，人類臨床無功能垂體腺瘤(NFAs)中MEG3選擇性表達缺失，但是此位點上其他基因的表達情況還未見報道。RT-PCR評估了44例人垂體腺瘤(臨床無功能垂體腺瘤25例、促腎上腺皮質激素腺瘤7例、生長激素腺瘤7例、催乳素腺瘤5例)和10例正常的垂體中DLK1-MEG3位點上24個基因的表達水平。流式細胞術分析了5個能抑制癌細胞增殖的miRNAs，發現其表達均很低。研究發現18個基因，包括DLK1-MEG3位點上的13個miRNAs的表達水平都明顯下調。促腎上腺皮質激素腺瘤和催乳素腺瘤中分別有9個和7個miRNAs明顯下調，而7個生長激素腺瘤中沒有。另外，miR-134轉染PDFS細胞后，其G2/M期受到阻滯。這些數據表明NFAs中DLK1-MEG3位點發生了沉默，且miRNAs能抑制PDFS細胞增殖，即人NFAs中DLK1-MEG3位點起著腫瘤抑制的作用[23]。

Chunharojrith等還發現MEG3能明顯抑制裸鼠體內移植瘤的生長，并阻滯細胞周期G1期。此外，p53基因失活完全阻礙了MEG3的腫瘤抑制作用，這表明MEG3的腫瘤抑制作用是由p53介導的[24]。

2.2 MEG3與腦膜瘤

腦膜瘤是最常見的惡性腫瘤，占中樞神經系統腫瘤的15%～25%。早期人們認為腫瘤的發生是由于染色體22上NF2基因的失活，但是原因尚未明確。染色體14q32異常與腦膜瘤的發生和發展有關，因此猜想該位點可能存在腫瘤抑制基因。

Zhang等對正常蛛網膜組織和不同分級的腦膜瘤組織通過RT-PCR檢測MEG3的表達，發現MEG3在正常蛛網膜組織和細胞中高表達，但在大多數腦膜癌組織和細胞中不表達，且MEG3表達水平與腫瘤分級有密切關系。基因組DNA甲基化分析提示，MEG3基因啟動子、增強子和印記控制區甲基化程度亦與腫瘤分級顯著相關。功能上，溴化脫氧尿苷摻入法和集落形成實驗提示MEG3可抑制腦膜瘤細胞DNA的合成和增殖，而無啟動子的MEG3和DLKL不能。且MEG3等位基因缺失，高級別腫瘤患病率增加。此外，MEG3能夠刺激癌細胞中p53介導的轉錄。這些數據表明lncRNA MEG3可能是一個抑癌基因[25]。

2.3 MEG3與肝癌

通過微陣列分析了惡性肝細胞中23 000個lncRNA，顯示有712(約占3%)個lncRNAs表達水平下調，其中，MEG3表達下調至1/210。Braconi等通過RT-PCR發現，與正常肝細胞相比，MEG3在4種人肝癌細胞株(HepG2、Huh-7、PLC-PRF/5、hep-3B)中的表達明顯減少。RNA原位雜交結果顯示MEG3在無腫瘤正常肝中表達很高，而在肝癌組織中不表達或低表達。肝癌細胞中過表達的MEG3能抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡。甲基化特異性PCR顯示MEG3啟動子發生甲基化，采用甲基化抑制劑或DNA甲基轉移酶處理癌細胞后MEG3的表達升高。由于miRNA-29a可以調節DNMT1/3，他們通過評估miRNA-29的表達來研究miRNA-29和MEG3的依賴性調節。過表達的miRNA-29a增加MEG3的表達水平。GTL2是MEG3的小鼠同源物，在肝細胞特異性miRNA-29a/b1基因敲除小鼠的肝組織中表達下調。這些數據表明miRNA-29低表達導致的lncRNA MEG3甲基特異性調節可能有助于肝癌的生長，這突出顯示了兩種非編碼RNA的相互關系，miRNA、lncRNA和基因表達的表觀遺傳調控[26]。

2.4 MEG3與肺癌

超甲基化已被證明能夠導致基因表達缺失，Kruer等證明了MEG3的表達通過Rb通路被調節，并與細胞增殖密切相關。微陣列分析了離體基因缺失小鼠和野生型小鼠的胚胎成纖維細胞的3個Rb家族(TKO)，Gtl2/MEG3的表達顯示出明顯的基因沉默，并且Gtl2/MEG3過表達能夠抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。帕博昔布是CDK4/6抑制劑，作用于A549和SK-MES-1細胞后，MEG3的表達呈劑量依賴性增加，但是pRb/p107敲除則會削弱此效果。此外，在2種肺癌細胞中，pRb的磷酸化不足突變體的表達能夠增加MEG3的水平。采用帕博昔布處理pRb磷酸化不足突變體細胞能降低pRb相關的DNA甲基轉移酶1(DNMT1)的表達，與此同時，DNMT1降低能導致MEG3表達升高。帕博昔布導致MEG3位點基因甲基化下調，其作用類似于5-氮雜-2-脫氧胞苷。對于藥物誘導MEG3表達的A549和SK-MES-1細胞，反義寡脫氧核苷酸沉默可以部分逆轉帕博昔布介導的細胞增殖抑制，而TCGA數據庫揭示了RB通路干擾的肺癌細胞中MEG3的表達減低。這些數據表明pRb-DNMT1通路的干擾導致MEG3表達降低，從而導致癌細胞的增殖[19]。

Lu等通過MTT法和克隆形成試驗發現，過表達的MEG3對非小細胞肺癌細胞SPC-A1、A549的增殖有明顯的抑制作用，Hoechst染色法和流式細胞儀檢測發現MEG3能促進細胞凋亡；一般來說，泛素-蛋白酶途徑的快速降解會導致p53蛋白水平下降，p53蛋白的泛素化主要是由MDM2(E3泛素連接酶)介導的。通過蛋白印跡法檢測轉染后SPC-A1細胞的蛋白水平，發現MDM2蛋白水平下降，p53蛋白水平上調，但p21Cip1(p53蛋白靶基因)蛋白水平無明顯變化，表明通過下調MDM2蛋白水平，MEG3能激活p53蛋白表達，但并不能刺激p21Cip1表達[28]。

2.5 MEG3與胰腺神經內分泌瘤

Modali等發現，胰腺神經內分泌腫瘤(PNETs)中MEN1基因編碼的menin蛋白雙等位基因的失活與多發性內分泌腫瘤Ⅰ型(MEN1)綜合征相關是公認的，但是menin缺失/失活是否引發腫瘤的發生尚未知曉。研究發現menin通過MEG3啟動子CRE位點上發生的組蛋白-H3賴氨酸-4甲基化和CpG低甲基化激活了MEG3，使轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白與之結合。MIN6細胞(胰島素分泌小鼠PNET細胞系)中MEG3的過表達能抑制細胞增殖，阻滯細胞周期，據此認為PNET細胞中MEG3有抑癌活性。基因微陣列分析提示MIN6鼠胰島細胞中MEG3的過表達下調了原癌基因c-MET(肝細胞生長因子受體)的表達，并明顯抑制了細胞遷移/侵襲。與正常細胞相比，鼠或人MEN1相關的PNETs中 MEG3表達下調，而c-MET表達上調。因此，通過將抑癌基因MEG3和抑制原癌基因c-MET的手段結合，能夠誘導menin蛋白的腫瘤抑制因子活性。MEG3和c-MET的表達在人散發性胰島素瘤中被改變，MEG3啟動子CRE位點超甲基化下調了MEG3的表達。這些數據也為β細胞功能維持相關增殖的機制闡明提供了新的視角。此外，DNA去甲基化藥物能抑制MIN6鼠胰島素細胞增殖，并激活MEG3的表達。這些數據表明通過lncRNA MEG3的表觀激活和c-MET的失活有望治療胰腺神經內分泌瘤和胰島素瘤[27]。

2.6 MEG3與前列腺癌

Ribarska等通過微陣列分析了前列腺良性組織和腫瘤組織中12種印記基因HYMAI，PLAGL1/ZAC1，CDKN1C，MEG3，PEG3，PEG10，SGCE，PPP1R9A，NDN，SNRPN/SNURF，INPP5F和GNAS的表達，發現它們存在明顯的統計學差異(P<0.05)。其中有9個基因(HYMAI,PLAGL1/ZAC1，SGCE，PEG10,INPP5F,CDKN1C，MEG3，NDN和PEG3)表達水平下調，PPP1R9A和GNAS表達上調，而SNRPN/SNURF在良性組織和腫瘤組織表達都較高，這可能是由基因特定轉錄變異體的差異表達引起的[29]。RT-PCR檢測發現前列腺癌腫瘤組織中MEG3表達較低，DMRs分析前列腺良性組織和腫瘤組織中CpGs平均甲基化水平無顯著性差異，ZAC1 DMR,KvDMR，7q21 DMR2，MEG3 DMR和NDN DMR甲基化程度達35%～70%。MEG3 DMR CpG2甲基化和MEG3的表達水平有較強的相關性(ρ=0.535，P<0.001)[30]。

Luo等RT-PCR檢測了21個前列腺癌患者腫瘤組織和癌旁組織中MEG3的表達水平，發現腫瘤組織中MEG3的表達水平顯著下調，此外，他們還評估了MEG3的表達與臨床病理參數的相關性，發現兩者并無顯著關系。過表達的MEG3能下調細胞周期調控蛋白Cyclin D1，并阻滯細胞周期G0/G1期，從而抑制前列腺癌細胞的增殖。為了探討體內MEG3水平上調是否能抑制腫瘤的形成，將穩轉質粒pCDNA MEG3和空載的PC3細胞分別皮下注射到裸鼠體內，發現MEG3組裸鼠腫瘤體積和體重均偏小。與免疫印跡結果相似，免疫組化分析顯示Bax上調，Cyclin D1和Bcl-2下調，且pCDNA MEG3組中caspase3活性增強。這些結果提示上調MEG3的表達能顯著抑制體內前列腺癌細胞的生長，并延緩腫瘤的生長進程。他們的研究提出MEG3在前列腺癌的分子病因學中發揮著重要作用，這表明MEG3在前列腺癌治療中有著潛在的作用[31]。

3 小結

已有研究表明，MEG3是一個重要的抑癌基因，其在大多數腫瘤中表達下調，并與整體預后相關。其主要機制包括：①染色體14q32是一個腫瘤抑制基因位點，其等位基因的丟失與實體瘤和血液系統惡性腫瘤的發病有關，而MEG3位于14q32位點；②在多種正常組織中表達，但在惡性腫瘤組織中低表達或表達缺失；③CpG甲基化導致MEG3表達沉默；④MEG3表達與腫瘤生長抑制相關；⑤MEG3與p53/MDM2的相互調節維持著細胞增殖。父系和母系表達基因DLK1/MEG3保持著動態平衡，而在實體瘤和血液系統惡性腫瘤中，這種平衡遭到破壞。此外，MEG3可能與MAPK信號通路相互作用從而抑制細胞增殖。

總之，lncRNA MEG3是一種極具應用前景的抑癌基因，但其在細胞生物學中的重要性以及其在腫瘤發生過程中的作用途徑仍有待進一步研究。