高脂高糖飲食暴露誘導大鼠多囊卵巢綜合征研究

古蘭·托合提木拉提，葉爾努爾·吐蘇甫汗，馬玉蘭，瑪依努爾·尼亞孜

(1.新疆自治區人民醫院，烏魯木齊 830001；2.新疆醫科大學第二附屬醫院，烏魯木齊 830001)

肥胖與女性的生殖功能障礙和不孕有關，肥胖女性比正常體重的女性更容易出現多囊卵巢綜合征(PCOS)、月經不調等問題。PCOS是女性不孕癥最常見的原因，研究發現約40%～80%的PCOS患者肥胖[1]。肥胖和PCOS均存在多種合并癥，如高胰島素血癥、胰島素抵抗以及其他代謝紊亂等[2]。此外，研究表明肥胖可進一步加劇PCOS患者的這些癥狀[3]。目前低熱量和低脂肪飲食是改善PCOS肥胖女性代謝和卵巢功能的有效療法[4]，但很少有研究將飲食本身作為PCOS的潛在病因。有研究發現高脂肪飲食可損害生殖健康并降低嚙齒動物的生育能力[5]，而因此將高脂飲食與藥物誘導PCOS動物模型相結合，但很少有研究單獨檢測飲食對PCOS及肥胖的發展的影響及兩者直接的聯系。本研究擬通過高脂肪高糖(high fat and high sugar，HFHS)飲食誘導雌性大鼠PCOS，評估大鼠代謝和生殖特征，以探討HFHS飲食對PCOS產生和發展的影響。

材料與方法

一、實驗動物

23日斷奶SPF級Sprague Dawley(SD)雌性大鼠36只購置于新疆醫科大學實驗動物中心(許可證號：SYXK(新)2013-0003)。飼養溫度(22±2)℃，相對濕度(55±5)%，12 h晝夜交替，清潔飼養，自由飲水，環境安靜，飼養環境符合SPF要求。

二、試劑與儀器

普通顆粒飼料(100%基礎飼料；含65%碳水化合物、21.5%蛋白質、4%脂肪和9.5%其他)和高脂肪飼料(24%基礎飼料、18%豬油、18%豆油、32%蔗糖、6%酪蛋白、2%其他)購自于新疆醫科大學實驗動物中心。

ACS-1.51A電子秤購自于上海友聲衡器有限公司。XS205分析天平購自于瑞士梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。血糖儀購自于德國羅氏診斷有限公司。全自動生化分析儀購自于美國Beckman公司。

三、實驗方法

1.動物分組及模型制作：23日齡SD大鼠隨機分為對照組(n=18)和HFHS組(n=18)。對照組采用普通顆粒飼料，HFHS組采用高脂高糖飼料，分別連續喂養14周。

2.大鼠體重及動情周期監測：每周稱重兩組大鼠體重并記錄。喂養第6～14周對每只大鼠進行陰道涂片檢查，用生理鹽水(0.9% NaCl)清洗陰道收集陰道壁上的細胞并涂抹在玻片上。在顯微鏡下檢查玻片上的有核上皮細胞、角化上皮細胞和白細胞的相對豐度，觀察大鼠動情周期變化。通過發情期、發情間期、發情前期各個階段持續天數除以整個發情周期天數，計算發情周期各個階段所占時間比例。

3.卵巢重量及組織學檢查：飲食暴露14周后，處死大鼠并分離卵巢。稱取卵巢重量后，以卵巢最大平面作為待檢面，將其包埋在石蠟中，切成4～5 μm的切片，隨后用蘇木精-伊紅染色后觀察。計數每個卵巢囊性卵泡(cyst)和黃體(Corpora lutea，CL)數量。

4.空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數、血清血脂及性激素檢測：每組大鼠在同一個發情周期中，分別于禁食過夜后，次日空腹采尾靜脈血。使用血糖儀測定空腹血糖(Fasting glucose，FG)；采用放射免疫法檢測空腹胰島素(Fasting insulin，FI)。穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)計算：HOMA-IR =FI×FG/22.5。

采用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)和三酰甘油(Triglycerides，TG)；采用放射免疫法測定血清LH、FSH、E2、孕酮(P)、睪酮(T)水平。

四、統計學分析

結 果

一、兩組體重增長曲線

HFHS組大鼠體重至第3周起顯著高于對照組(F=80.17，P<0.001)(圖1)。第14周喂養結束時，HFHS組大鼠體重顯著高于對照組[(379.0±11.1)g vs. (315.0±6.2)g，P<0.001]。

同時段兩組比較，*P<0.001圖1 兩組體重增長曲線

二、兩組發情周期變化

陰道涂片評估發情周期發現，HFHS組出現不規則的發情周期和無排卵。第14周喂養結束時，HFHS組發情期持續時間顯著長于對照組(P<0.001)，而發情前期和發情間期持續時間則顯著短于對照組(P<0.001)(表1)。

三、兩組卵巢重量和卵巢組織形態學變化

HFHS組的卵巢重量與對照組無統計學差異(P>0.05)。HFHS組卵巢平均囊性卵泡數顯著多于對照組，而卵巢平均黃體數顯著低于對照組(P<0.001)(表2、圖2)。

四、兩組空腹血糖、胰島素、HOMA-IR、血脂及激素水平變化

HFHS組空腹胰島素和HOMA-IR顯著高于對照組(P<0.001)，提示HFHS組大鼠也表現出胰島素抵抗；HFHS組TC顯著高于對照組(P<0.001)(表3)。發情間期HFHS組LH和E2水平顯著低于對照組(P<0.05)，T水平顯著高于對照組(P<0.001)(表4)。發情前期HFHS組LH和P水平顯著低于對照組(P<0.05)，T和E2水平顯著高于對照組(P<0.001)(表5)。

表1 兩組發情周期各階段在發情周期中的時間占比(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.001

表2 兩組卵巢重量和卵巢組織形態學比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.001

A：HFHS組；B對照組；Cyst：囊性卵泡；CL：黃體圖2 兩組卵巢組織形態學變化(HE染色 ×100)

組 別例數空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(mU/L)HOMA-IRTG(mmol/L)TC(mmol/L)對照組 187.73±0.3511.24±2.812.98±1.060.74±0.321.98±0.13HFHS組187.89±0.2829.21±3.99*8.87±2.96*0.57±0.212.30±0.21*

注：與對照組比較，*P<0.001

表4 兩組發情間期激素水平比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.001

表5 兩組發情前期激素水平比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.001

討 論

飲食誘導的肥胖與女性生殖疾病的發展密切相關。PCOS是一種以生殖障礙和代謝紊亂為特征的婦科疾病。PCOS患者往往體重過重，而且肥胖與PCOS存在一些合并癥。此外，飲食本身可能在PCOS發病機制中也發揮重要作用。本研究通過HFHS飲食誘導雌性大鼠肥胖和PCOS，探究HFHS飲食是否能導致PCOS及其相關的代謝紊亂和生殖特征。PCOS診斷的標準為無排卵、高雄激素血癥和多囊卵巢。本研究中，HFHS飲食的動物表現出無排卵、多囊卵巢。本研究中睪酮水平在發情前期和發情間期均升高，提示高雄激素血癥在此PCOS動物模型中也可能出現。與前人使用雄激素誘導的PCOS動物模型不同，本研究建立的PCOS模型或許更接近人類PCOS疾病病因學。

本研究中HFHS飲食對動物的生殖健康有明顯的影響。在動情周期監測期間，HFHS飲食動物表現出異常發情周期，每日陰道涂片顯示這些動物已進入持續角化狀態。而且HFHS動物在發情期持續時間比對照組長。這種無發情規律的無排卵狀態與PCOS患者一致，而且多項研究中也將陰道涂片持續角化狀態認為是PCOS嚙齒動物不規則發情周期和無排卵的標志物[6]。HFHS動物在發情間期和發情前期持續時間顯著比對照組短，表明這些動物的排卵活性降低。此外，HFHS飲食動物的卵巢結構也發生了形態學變化。組織學分析顯示多囊卵巢的形成伴隨著黃體形成減少，表明排卵活性降低。黃體的形成減少與以前的嚙齒動物PCOS模型一致[7]。盡管兩組的卵巢重量無統計學差異，但HFHS動物組織中存在大量囊性卵泡，這一結果與以往PCOS動物模型的結果不同，其他多種PCOS動物模型中卵巢重量顯著增加[8]，這可能與HFHS飲食有關。總之，HFHS飲食不僅會導致動物進入不規則的發情周期，其特征表現在發情期持續時間增加，而且還可通過影響卵泡發育來誘導卵巢結構的變化。

本研究中HFHS組體重顯著高于對照組，且表現出高胰島素血癥，這類似于PCOS患者的代謝特征。HFHS可誘導高胰島素狀態具有重要意義，研究顯示胰島素水平升高可導致卵巢卵泡膜細胞的雄激素產生增加[9]。雄激素水平升高與無排卵有關[10]，并與異常卵泡成熟和加速大鼠卵泡閉鎖有關[11]。盡管過量的雄激素促進了卵泡的早期生長，但它在發育的后期也誘導卵泡發育停滯[12]。雄激素過量可能是由于高胰島素血癥引起的胰島素信號傳導增加或卵巢內類固醇生成改變引起的[13]。本研究中HFHS飲食誘導高胰島素血癥發生，且觀察到雄激素水平也增加，與前人研究一致[8]。睪酮水平升高可能是高胰島素血癥發展的繼發效應，并在HFHS飲食誘導的PCOS的疾病發生發展中出現。在胰島素抵抗和高胰島素血癥動物中囊腫發生率高，睪酮水平升高，卵巢內胰島素信號的增加可能導致卵巢形態改變和卵巢產生雄激素增加[14]。雖然PCOS患者可能發展成胰島素抵抗，但卵巢仍然對胰島素信號產生反應以產生雄激素[15]。因此，睪酮水平的升高可能是胰島素誘導多囊卵巢形成的結果，而胰島素可能會導致或加速PCOS癥狀的出現。

受損的胰島素信號轉導可能是高胰島素血癥的副產物，也與LH釋放有關。HFHS大鼠在發情前期LH顯著降低、E2顯著增加。E2水平異?？赡芘cLH波動的破壞有關。這可能表明排卵前期正反饋循環受損。本研究中HFHS大鼠發情前期P水平顯著降低。研究表明排卵前的P分泌對調節LH激增誘導的排卵至關重要[16]，提示P對LH分泌的反饋非常重要。大鼠排卵前P水平較低可能會阻止LH激發啟動排卵。因此，HFHS大鼠的卵巢形態改變可能是卵泡發育晚期激素失衡的結果。

總之，本研究通過HFHS飲食誘導雌性大鼠PCOS的特征，而非由外源激素誘導或通過改變類固醇生成途徑誘導，這提示HFHS飲食也可能誘導人PCOS，從而導致生殖健康受損及代謝紊亂。本研究為闡明肥胖與PCOS之間的潛在機制提供了一種可利用的動物模型。