CD19+CD24hiCD38hi調節性B細胞在復發性流產合并抗磷脂綜合征患者中的表達及意義

陳現，何書貴，連若純，林蓉，何來賓，曾勇

(深圳中山泌尿外科醫院生殖醫學中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

復發性流產(recurrent miscarriage，RM)是妊娠期常見的一種并發癥，也是婦產科中較難處理的疾病，是指在同一性伴侶的情況下連續發生2次及2次以上的自然流產，在育齡女性中發病率為1%～3%[1]。RM的病因主要包括遺傳、內分泌和解剖結構異常、感染等因素，另外還有約40%～50%的RM患者病因不明確。目前，人們普遍認為抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)是RM的重要病因之一[2]。APS的發病機制被認為主要與血小板活化以及內皮細胞受損等有關[3]。因此，目前臨床上對患有APS的RM患者的治療主要關注于如何預防血栓的形成，然而，抗凝治療只對部分患者有效[3-4]。而早期的研究表明APS患者炎性反應異常[5-6]，但是其具體機制尚不清楚。近年來隨著對自身免疫性疾病的不斷深入，人們發現調節性B細胞(regulatory B cells，Breg)是一類具有免疫調節功能的B淋巴細胞亞群，在自身免疫性疾病中起重要的免疫調節作用，Breg細胞的缺失可加重自身免疫反應[7-8]。而APS作為一種系統性的自身免疫性疾病，同時又可繼發于SLE或者其它自身免疫性疾病[3]。因此，本研究應用流式細胞術檢測RM合并APS患者外周血Breg細胞比例以及表達IFN-γ和TNF-α的輔助性T細胞(T helper cells，Th)的比例，探討RM合并APS患者外周血Breg細胞參與調控免疫炎癥反應的分子機制，為患有APS的RM患者的治療提供新思路。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年1月至2018年3月首次來本院治療的18例RM合并APS患者(APS/RM組)和37例非APS的RM患者(Non-APS/RM組)為研究對象，所有患者均經過詳細詢問病史、染色體核型分析、全身及婦科檢查、宮腔感染和宮腔鏡以及內分泌等系統性檢查。同時選取在本中心工作的具有至少1次以上正常妊娠史的女性，共11例為對照組。

APS/RM患者的入選標準：(1)符合RM的定義：是指在同一性伴侶的情況下連續發生2次及2次以上的自然流產；(2)實驗室標準：至少間隔12周的2次或2次以上發現血清中存在中等或者高滴度的IgG型和/或IgM型抗心磷脂抗體或抗β2糖蛋白I抗體；(3)夫婦雙方染色體正常；(4)女方生殖解剖結構正常、內分泌正常、無其它自身免疫性疾病。

Non-APS/RM患者的入選標準：(1)符合RM的定義：是指在同一性伴侶的情況下連續發生2次及2次以上的自然流產；(2)夫婦雙方染色體正常；(3)女方生殖解剖結構正常、內分泌正常；(4)無自身免疫性疾病、抗磷脂抗體陰性、無高凝傾向。

對照組的入選標準：(1)夫婦雙方染色體正常；(2)女方生殖解剖結構正常、內分泌正常、無自身免疫性疾病，月經規律；(3)經自然受孕且有正常生育史者。

所有研究對象均在月經周期的黃體中期首次抽取外周血，并于當天分別檢測Breg細胞比例，以及表達IFN-γ和TNF-α的Th細胞比例。本研究入選患者均簽署了知情同意書，實驗流程獲得醫院學術與倫理學委員會許可。

二、實驗方法

1.流式細胞術檢測CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞的數量：將100 μl 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加入到流式管中；然后加入CD19-APC (BD，美國)、CD24-PE (BD，美國)、CD38-PE-Cy7 (BD，美國)，振蕩混勻，避光、室溫孵育 15 min；加入紅細胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；進行1 300 r/min離心6 min，去上清；加入含有5%血清的PBS 2 ml充分混勻，再進行1 300 r/min離心6 min，去上清；加入200 μl PBS 進行細胞重懸；利用DxFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter，美國)進行檢測，并用CytExpert 1.1軟件進行結果分析。

2.流式細胞術檢測表達IFN-γ和TNF-α的Th細胞的比例：將 100 μl EDTA抗凝全血加入到流式管中；然后加入CD3-PerCP (BD，美國)、CD8-APC-Cy7 (BD，美國)，振蕩混勻，避光、室溫孵育15 min；加入紅細胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；1 300 r/min離心6 min，去上清；加入含有5%血清的PBS 2 ml充分混勻，1 300 r/min離心6 min，去上清；加入500 μl Perm2進行破膜10 min；加入含有5%血清的PBS 2 ml充分混勻，1 300 r/min離心6 min，去上清；加入IFN-γ-FITC (BD，美國)和TNF-α-APC (BD，美國)，避光、室溫孵育15 min，加入PBS 2 ml充分混勻，1 300 r/min離心6 min去上清；加入200 μl PBS進行細胞重懸；利用FACSCanto II流式細胞儀(BD，美國)進行檢測，并用 FACSDiva軟件進行結果分析。

3.性激素測定：月經第2～3天收集患者外周血，化學發光法檢測血清FSH、E2、P及LH水平(Cobas E601，Roche，瑞士)。

三、統計學分析

結 果

一、各組研究對象基本資料比較

與對照組相比，APS/RM組和Non-APS/RM組的年齡、身體質量指數(BMI)、E2、LH、FSH、泌乳素(RPL)和孕酮(P)的表達水平均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組基線資料比較

二、外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞在APS/RM患者中的變化情況

在黃體中期，收集對照組11例、APS/RM組18例及Non-APS/RM組37例患者的外周血，分析三組中外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞的比例。與對照組比較，CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞比例在APS/RM組[(3.42±1.31)% vs.(7.16±1.28%)]和Non-APS/RM組[(4.79±1.10)% vs. (7.16±1.28%)]顯著降低(P<0.01)。此外，與Non-APS/RM組相比，APS/RM組外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞比例顯著降低(P<0.01)(圖1)。

三、外周血表達IFN-γ或TNF-α的Th細胞在APS/RM患者中的變化情況

外周血表達IFN-γ的Th細胞比例在APS/RM組[(29.20±8.01)% vs.(20.60±2.63)%，P<0.01]和Non-APS/RM組[(25.00±6.06)% vs. (20.60±2.63%)]中均顯著高于對照組(P<0.01)，且APS/RM組中表達IFN-γ的Th細胞比例顯著高于Non-APS/RM組的比例(P<0.05)(圖2B)。同樣地，表達TNF-α的Th細胞比例在APS/RM組[(46.30±7.36)% vs. (29.70±3.94)%，P<0.01]和Non-APS/RM組[(39.70±9.35)% vs. (29.70±3.94)%，P<0.01]中顯著高于對照組；與Non-APS/RM組相比，APS/RM組中表達TNF-α的Th細胞比例也顯著增加(P<0.05)(圖2C)。

A：細胞比例的流式散點代表圖；B：細胞比例的統計圖；相互比較，**P<0.01圖1 APS/RM患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞的比例

A：表達IFN-γ或TNF-α的Th細胞比例的流式散點代表圖；B：表達IFN-γ的Th細胞比例統計圖；C：表達TNF-α的Th細胞比例統計圖；相互比較，**P<0.01，*P<0.05圖2 APS/RM患者外周血表達IFN-γ或TNF-α的Th細胞的比例

四、外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞比例與表達IFN-γ和TNF-α的Th細胞比例之間的相關性分析

進一步分析CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞與表達IFN-γ和TNF-α的Th細胞比例的相關性。在對照組中CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞比例與表達IFN-γ (r2=0.38)和TNF-α (r2=0.49)的Th細胞比例均呈顯著負相關性(P<0.05)，而在APS/RM組和Non-APS/RM組中無顯著相關性(P>0.05)(圖3)。

圖3 外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞比例與表達IFN-γ和TNF-α的Th細胞比例的相關性

討 論

成功的妊娠依賴于母體內由眾多免疫細胞及細胞因子參與的精密的免疫調控，使得母體對胎兒產生免疫耐受，維持妊娠，一旦這些調控失衡就可能導致流產等不良妊娠結局[9]。由于B細胞可以產生自身抗體，一直以來多被認為在自身免疫性疾病中發揮著正向免疫調節功能。過去二十年間研究人員也發現了B細胞所具備的其它免疫學功能，包括抗原提呈及依賴于分泌IL-10發揮免疫抑制作用等[10]。Breg細胞是一群可以降低炎癥誘導免疫耐受的B細胞新亞群，主要通過以下兩種途徑來發揮負性調控：一方面，主要通過分泌細胞因子的方式發揮免疫調節作用，其中以IL-10為主導作用，可直接作用于初始CD4+T細胞，通過抑制Th1細胞亞群分泌IFN-γ、TNF-α和IL-12，影響Th細胞的分化與成熟；另一方面，Breg細胞可通過表面分子B7、CD40與T細胞表面的CD28、CD40L分子相互作用來調節免疫應答[11]。研究發現，正常妊娠女性外周血中Breg細胞的比例顯著高于復發性流產女性組，而且在正常妊娠女性組中它們可以抑制母體T細胞的活化及炎性因子TNF-α的分泌[12]。本研究數據顯示在Non-APS/RM患者外周血中CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞比例顯著低于對照組，且IFN-γ和TNF-α的表達水平比對照婦女組均顯著增加。這些結果均表明Breg細胞在成功妊娠過程中對免疫應答和免疫耐受的調節起著關鍵的作用。

眾所周知，復發性流產是婦產科常見的疾病，發病原因可能與遺傳、內分泌、子宮解剖結構、感染和免疫等因素異常有關，其中有很大一部分是與自身免疫異常有關[13]。APS作為一種系統性的自身免疫性疾病，以動靜脈血栓形成、復發性流產和血小板減少等為臨床表現，以體內產生大量抗磷脂抗體為特征。APS發病機制非常復雜，確切的發病機制尚未闡明，對該病的研究主要集中在自身抗體介導的血栓形成方面，主要包括蛋白C軸抑制、凝血酶生成增多、補體失衡、內皮細胞激活、血小板激活等[3]。近年來，動物模型的證據表明抗磷脂抗體會導致蛻膜和全身性的TNF-α水平迅速增加[5]。且早期對人類的研究發現，抗磷脂抗體陽性的RM女性TNF-α啟動子基因水平顯著升高[6]。我們的數據也表明在APS/RM組中，IFN-γ和TNF-α的表達水平顯著高于對照組和Non-APS/RM組。這些結果均提示APS導致RM可能與免疫炎癥反應有關，但是其具體機制目前尚不清楚。

近年來，隨著對炎癥免疫相關疾病病理機制認識的不斷深入，部分小鼠模型試驗證實Breg細胞對疾病病情控制和治療有著至關重要的作用。在人類許多自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡(SLE)和多發性硬化病(multiple sclerosis，MS) 中均發現Breg細胞的數量或功能的缺乏或丟失均可加重自身免疫反應[7-8]。在人類MS中發現分泌IL-10的Breg細胞數量減少，但經過治療后細胞數逐漸恢復正常[14]。來自MS患者外周血的Breg細胞可以抑制T細胞的增殖和IFN-γ的產生，但對Breg細胞采用RNA沉默IL-10后，這種抑制功能喪失[15]。另外，在SLE患者中發現其外周血中CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞雖然數量上并沒有減少，但在anti-CD40 mAb及CpG的刺激下沒有產生IL-10，也不能抑制Th1細胞的反應[7]。在本研究中我們發現，與對照組和Non-APS/RM組比較，APS/RM患者組中CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞比例顯著降低，同時伴隨著IFN-γ和TNF-α的表達水平的升高。而且，相關性分析顯示，在對照組中，IFN-γ和TNF-α的表達水平隨著CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞比例的升高而降低，呈顯著負相關性；而在APS/RM組和Non-APS/RM組中無顯著負相關性。由此可見，在正常妊娠過程中，Breg細胞數量的平衡對免疫炎癥反應的調控有著重要的作用，而在APS/RM組和Non-APS/RM組中，Breg細胞數量可能都發揮了一定的調控作用，特別是在APS/RM組，Breg細胞數量過低而導致了IFN-γ和TNF-α的表達水平的顯著升高。這些結果提示，APS/RM患者中CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞數量失衡可能在APS介導的免疫炎癥反應而導致流產的過程中發揮關鍵作用。這一發現打破了人們以往對于APS引起RM的病理機制的認識，有助于對RM合并APS患者病情演變及預后的判斷提供新的評判指標。因此，深入研究Breg細胞參與APS介導的炎癥反應的調控機制，對于探索一種有效的RM合并APS的治療方法具有非常重要的科學意義。