一株鴿新城疫病毒Pi/YN/CH/0122/2018株的分離鑒定

李敏，和春林，嚴紅亞，信愛國，常志順*

(1. 云南省畜牧獸醫科學院 養禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2. 硯山縣維摩鄉畜牧獸醫工作站，云南 硯山 663100；3. 麗江市古城區大東鄉農業綜合服務中心，云南 麗江 674100)

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染引起的一種急性、烈性、高度接觸傳染性禽類傳染病，被世界動物衛生組織(OIE)列為必報傳染病之一[1]。NDV屬于副黏病毒科，是一種單股、負鏈、線性、不分節段的RNA病毒，只有一個血清型，但因宿主范圍、毒力不斷演變，NDV 給養殖業帶來了巨大的經濟損失。NDV根據致病力差異，可分為弱毒株、中等毒力株和強毒力毒株三種類型。

鴿新城疫，最早被稱為鴿副黏病毒病，是由I型禽副黏病毒引起的一種高度接觸性、敗血性傳染病。該病病原與雞NDV在血清學上沒有顯著差異，兩者基因序列同源性較高。隨著時間的推移及飼養方式的改變，鴿Ⅰ型副黏病毒呈現流行廣、傳播快的特點。迄今為止，我國華南、華北、華東等地區大部分省份都有該病的報道，給我國養鴿業造成了重大的經濟損失[2]。

本實驗通過對云南某賽鴿公棚疑似自然感染NDV的病死鴿采集的病料進行病原分離鑒定及分子流行病學分析，旨在為臨床診斷NDV感染提供實驗室檢測依據，了解云南省鴿源新城疫病毒感染情況以及為防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料

2018年5月，云南某賽鴿公棚出現幼鴿發病，發病率12%，死亡率8%，送到本研究所進行臨床解剖及實驗室診斷，采集病料進行分離鑒定。

1.1.1雞胚和NDV病毒

9日齡非免疫健康雞胚本研究所提供，LaSota株疫苗毒，本研究所保存。

1.1.2陽性血清

NDV、禽流感病毒(H5、H7、H9亞型)標準陽性HI血清購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，減蛋綜合征病毒(EDSV-76)HI血清由本研究所制備保存。

1.2 分子生物學試劑及引物合成

RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR所用的分子生物學試劑均購自TaKaRa公司。參考新城疫診斷國家標準(GB/ T 16550-2008)合成引物[3]，擴增上游引物：5′-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3′，下 游 引 物：5′-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。擴增產物直接送昆明碩擎生物科技有限公司測序。

1.3 病毒分離

采取病死鴿的肝、肺臟組織，剪碎，加滅菌生理鹽水研磨，反復凍融3次，加入雙抗(青霉素和鏈霉素)1000IU/mL， 4℃過夜，12000r/min離心5min，取上清液經尿囊腔接種9日齡非免疫健康雞胚，置37℃孵化器內培養7d，每12h觀察一次雞胚死亡情況。24h后死亡以及結束孵化時存活的雞胚置4℃冰箱4～24h，收獲尿囊液備用，觀察胚體病理變化。

1.4 病毒鑒定

1.4.1血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗

按照常規方法[4]測定收集的尿囊液的HA效價，并以抗NDV、EDSV、H5、H7、H9標準陽性血清進行HI試驗。

1.4.2病毒MDT測定

參考國家標準(GB/ T 16550-2008)進行 MDT 測定[3]，將病毒尿囊液用滅菌生理鹽水連續10倍稀釋；每個稀釋度經尿囊腔接種5枚9日齡的SPF雞胚，每枚按0.1mL/接種，置37℃孵化器內培養，棄去24h內死亡胚，以后每6h照蛋一次，連續觀察7d，記錄各雞胚的死亡時間。按Karbre氏法計算EID50，并根據所有胚胎死亡的最高稀釋度計算MDT。

1.4.3病毒RNA的提取及PCR擴增

取收集的病毒雞胚尿囊液300μL于滅菌的3mL EP管中，再加入1000μL Trizol試劑，混勻，室溫靜置10min；加入200μL氯仿，輕輕混勻，室溫作用10min；4℃、1200r/min離心15min；取上清，加入上清相同體積的異丙醇，振蕩混勻后室溫靜置10min；4℃、1200r/min離心10min；棄上清液，加 入1000μL 75%乙醇洗滌；4℃、1200r/min離心5min，棄去上清液，室溫靜置晾干，加40μL ddH2O溶解。提取的RNA立即進行RT-PCR，RT-PCR步驟按試劑盒說明書進行，PCR反應條件為94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，進行35個循環，最后再72℃延伸7min。取5μL反應產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳成像觀察。

1.4.4 PCR產物核酸序列測定及進化樹的構建

按DNA膠回收試劑盒的操作進行PCR產物回收，送公司測序，參考已報道的方法[5]，根據已發表的NDV主要參考毒株構建該毒株的系統進化發育樹，所用NDV參考毒株信息見表1。

表1 所用NDV參考毒株信息

2 結果與分析

2.1 發病鴿臨床癥狀及剖檢情況

經臨床解剖及流行病學調查，初步診斷為疑似新城疫感染。發病鴿臨床癥狀表現為精神萎靡，羽毛蓬亂，體溫升高，食欲下降，咳嗽，呼吸困難，有黏性鼻液，張口呼吸，拉黃色或綠色稀便，翅膀下垂，有扭頭、轉圈等神經癥狀，后期病鴿因癱瘓無法采食，衰竭死亡。耐過鴿扭頭、轉圈等神經癥狀明顯。剖檢可見全身黏膜出血，淋巴結腫大、出血，腺胃黏膜出血、壞死，盲腸扁桃體腫大、出血，腦組織充血水腫。該公棚鴿發病前1周進行過頸部皮下0.5mL/羽LaSota 株滅活疫苗免疫，經檢測，發病鴿血清NDV抗體HI效價為 24～26。

2.2 接種后死亡胚體的病變觀察

接種24 h后雞胚開始陸續出現死亡，雞胚死亡時間為接種后24～96h，胚體全身性出血、水腫，頭頸部、足趾和翅膀出血嚴重,見圖1。

1、2、3為感染病毒后雞胚，4、5為正常雞胚

2.3 病毒鑒定

雞胚尿囊液毒可凝集雞紅細胞，雞胚死亡時間為接種后24～96h，其血凝性可被 NDV陽性血清抑制，不能被EDSV、H5、H7和 H9亞型的陽性血清抑制，證明所分離到的病毒為新城疫病毒，命名為Pi/YN/CH/0122/2018(簡稱YN0122)。

2.4 EID50及 MDT 的測定結果

盲傳2代后尿囊液毒HA效價為7log2，對雞胚的 EID50為 10-7.5/ 0.1mL；MDT為 66h，最小致死量為10-6，結果表明該分離株為中等偏強毒力毒株。

2.5 RT-PCR擴增結果

對提取的病毒尿囊液RNA進行PCR擴增，經2%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結果得到約500bp目的核酸片段，與預期結果相符(見圖2)。

M：DNAMark；S：分離株病毒；+：NDV LaSota 株陽性對照；-：陰性結果對照

圖2目的片段PCR擴增結果

2.6 核酸序列比對分析

測定上述PCR擴增產物核酸序列，應用DNAStar 6.0對YN0122進行序列拼接與比對分析，并用MegAlign軟件構建系統進化樹(見圖3)。結果表明，分離株YN0122與傳統NDV疫苗LaSota株和標準強毒株北京株F48E9、NDV V4株、鵝副黏病毒病代表株YG98-2C4的核苷酸序列同源性分別為81.2%、82.4%、81.4%和87.2%，同源性較低，遺傳距離較遠，而與鴿源Italy分離株14VIR8258-2同源性為91.3%，遺傳距離較近。該毒株F基因裂解位點氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，與NDV強毒株的F 基因裂解位點的氨基酸結構一致，見表1、表2。

表2 9株 NDV F基因核苷酸同源性的比較

1：YMF3(AY390313)；2： 14VIR8258-2(KU377537)；3： CHGDYF14(KR014814)；4：F48E9 (AY508514)；5：Lasota(DQ195265)；6： SFR-129(KX268689)；7： V4(JX524203)；8： YG98-2C4(AY390311)；9： YN0122

圖3基于NDV F基因的遺傳進化樹

3 小結

本試驗采用傳統的雞胚接種方法分離病毒，病料接種雞胚盲傳 2 代后，發現收獲的雞胚尿囊液具有血凝活性，能與紅細胞發生凝集反應，其 HA 效價為 24～26。HI 試驗結果證明，該分離株的血凝活性只能被NDV 標準陽性血清所抑制，初步鑒定該分離株為NDV。F2代尿囊液毒EID50為 10-7.5/ 0.1mL；MDT為 66h，最小致死量為10-6。用RT-PCR檢測，得到預期特異性擴增目的片段。明確了從病死鴿子中分離到的是一株NDV。根據擴增片段核酸系列比對分析證實，分離株YN0122 F基因編碼的氨基酸裂解位點序列為112R-R-Q-K-R-F117，與NDV強毒株的F基因裂解位點的氨基酸結構一致，YN0122株具有中等毒力偏強的特征。

鴿新城疫病毒又稱鴿Ⅰ型副黏病毒，屬于副黏病毒科、副黏病毒屬，只有一個血清型，但不同毒株的毒力表現出很大的差異[5]，鴿Ⅰ型副黏病毒和雞新城疫病毒同為一屬，含有極為相似的抗原成分[6]。本實驗所分離到的鴿新城疫毒Pi/YN/CH/0122/2018株，根據試驗結果初步判定為中等偏強新城疫病毒，但有文獻報導，鴿新城疫病毒(鴿Ⅰ型副黏病毒)的毒力和致病性不能完全由F基因裂解位點的特征性結構決定[7]，主要通過動物試驗的方法進行測定[8]。因此，要弄清楚分離株的毒力和致病性，還需進行動物回歸試驗。

此次發生疫情的賽鴿公棚免疫過LaSota 株滅活疫苗，正常及發病鴿新城疫血清抗體HI效價達 24～26。針對本次鴿源NDV感染不能提供完全的保護，可見，盡管NDV只有一個血清型，但不同毒株的毒力存在差異；本試驗YN0122株F蛋白基因與LaSota株同源性為81.2%，同源性較低，遺傳距離較遠，生產實踐中使用LaSota疫苗對鴿進行免疫存在免疫失敗的風險。因此，了解鴿NDV的生物學特性，為新城疫的防制提供重要的理論依據。

鴿新城疫是一種急性、烈性傳染病，給賽鴿公棚造成了嚴重的經濟損失。賽鴿公棚每年春季會從全國各地收購幼鴿，集中飼養、訓練后參加秋季的賽飛比賽。復雜的幼鴿來源背景、疫苗免疫情況以及賽鴿在野外飛行訓練過程中，易接觸到攜帶有新城疫病毒的野生鳥類，此養殖模式易使新城疫等傳染病發生并在鴿群中擴散。因此，研究制定并實施包括新城疫在內的疫病綜合防控措施對公棚賽鴿養殖尤顯重要。