豬圓環病毒1型與2型雙重PCR檢測方法的建立及應用

王立嬌，胡勝云，張 雪, 3，陳天慧，于紅欣，周雙海*

(1.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2. 房山區動物疫病預防控制中心，北京 102400；3. 懷柔區動物疫病預防控制中心，北京 101400)

以斷奶后多系統衰竭綜合征為主的豬圓環病毒(porine circovirus，PCV)疾病是危害當前養豬業的一種重要傳染病，豬圓環病毒2型(PCV2)是其必需病原[1]。先于PCV2之前發現的PCV1也存在于一些豬群和傳代細胞系中[2, 3]，雖然一般認為其無明顯致病性，但有研究報道PCV1可能具有潛在致病性或影響疾病的發展[4, 5]，且其全基因組核苷酸序列在大多數區域與PCV2具有高度一致性[6]，故PCV1的存在或污染很可能會干擾PCV2的檢測或研究結果。建立一種快速鑒別PCV1與PCV2的檢測方法是必要的。

目前，PCR技術已成為檢測病原的快速、特異、敏感的一種方法。雖然熒光PCR方法在敏感性方面有時高于常規PCR方法[7, 8]，但其檢測成本較高。與單項PCR檢測方法相比，多重PCR方法在檢測多種病原時可明顯提高檢測效率。本研究旨在建立一種能夠快速鑒別PCV1和PCV2的雙重PCR檢測方法，并初步進行臨床應用。

1 材料與方法

1.1 病毒模板

PCV1、PCV2、豬細環病毒(TTSuV)、偽狂犬病病毒(PRV)等病毒DNA模板由本實驗室保存。

1.2 引物設計

根據GenBank中的PCV1和PCV2核苷酸序列，用primer 5.0軟件設計2對特異性引物，引物序列分別為1U：5′-CGAAGGCCGATTTGAAGCAGTG-3′、1F：5′-TGCACAGCCCAAAATTATGTGGTAAG-3′和2U：5′-GGTTAGGGCATTGGCCTTT-3′、2F：5′-TCCCGCACCATCGGTTAT-3′，目的片段大小分別為184 bp和264 bp。

1.3 單項PCR方法的擴增產物鑒定及其條件篩選

用2×Taq MasterMix建立25 μL PCR反應體系，其中含有1.5 μL的病毒DNA模板、10 pmol上游引物與10 pmol下游引物。PCR反應程序為：95℃ 4 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，35 cycles；72℃ 10 min。之后取6 μL PCR擴增產物在20 g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳觀察，并回收純化目的PCR產物進行克隆與測序，對測序結果在NCBI上進行BLAST比對。……