豬圓環病毒2型感染對豬小腸上皮細胞Claudin-1蛋白和閉鎖小帶蛋白-1基因mRNA表達的影響

楊昕坦，阮 崢，李煥榮

(北京農學院動物科學技術學院，北京 102206)

豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)感染引起的腸炎可威脅斷奶仔豬生長，腸炎過程伴隨腸黏膜屏障功能損傷[1]和小腸黏膜免疫系統功能的下降。小腸腸道黏膜屏障可防止致病性物質的侵入和阻止腸道內細菌及內毒素的移位[2]，對保護機體腸道健康具有重要的作用。腸道黏膜上皮的完整性及正常的再生能力是腸黏膜屏障的結構基礎，腸黏膜屏障功能的損害可引起通透性增高，誘發炎癥反應[3]。緊密連接在腸壁通透性、阻止內毒素和毒性大分子物質進入體內發揮著尤為重要的作用[4]。Claudins等4種跨膜蛋白與連接復合物蛋白、細胞骨架結構共同構成緊密連接復合物[5]，Claudin-1蛋白(Claudin-1)和閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)在細胞緊密連接蛋白的表達和合成中發揮重大作用[6]。

IPEC-J2細胞系(Intestinal porcine epithelial cell line)具有完整的上皮細胞特征，PCV2可感染IPEC-J2并增殖[7]。本研究基于熒光定量PCR方法，通過基因克隆構建Claudin-1和ZO-1重組質粒的標準曲線，探索PCV2感染的IPEC緊密連接蛋白的mRNA動態變化，為PCV2感染損傷腸黏膜屏障的機制提供試驗數據。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞及主要試劑

PCV2 SD/2008株：第3代(TCID50為105.25/mL)；豬小腸上皮細胞系(IPEC-J2.ACC701，DSMZ)中國農業大學惠贈；TRIzol LS Reagent購自Invitrogen；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、DNA快速膠回收試劑盒、高純度質粒小提中量試劑盒等均購自北京博爾優公司。

1.2 方法

1.2.1 PCV2感染豬小腸上皮細胞病毒載量的測定 參考文獻方法[8]，將處于對數生長期的IPEC接種于6孔板中，每孔細胞數為3×105個，用10%DMEM培養基培養至細胞達60%，感染組以MOI=0.1感染PCV2毒株。分別于感染后4、12、24、48、72 h收集相應的小腸上皮細胞。……