2種豬冠狀病毒雙重RT-PCR檢測方法的建立與應用

溫海京，賈超偉, 2，劉芊麟，張喜喜，劉鑫宇，周雙海*

(1. 北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2. 門頭溝區動物疫病預防控制中心，北京 102300)

近年來，以豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)為主要病原引起的傳染性腹瀉給國內養豬業造成嚴重經濟損失[1-3]。PEDV和豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)都是專嗜胃腸道而致傳染性腹瀉的2種冠狀病毒[4]，二者感染致病后的臨床癥狀、病理變化和流行病學都非常相似，導致難以進行臨床鑒別診斷，必須進行實驗室檢測與鑒別診斷。

目前，PCR技術因特異性強、敏感性高、能夠進行早期快速檢測而被普遍用于傳染病與其病原的檢測與診斷。當前檢測病原的PCR技術主要有常規PCR和熒光定量PCR，雖然后者在特異性與敏感性方面更高一籌[3, 5, 6]，但其需要昂貴設備、且檢測成本較高，故其實用性并不一定強于前者。單項PCR檢測方法在一次PCR反應中只能檢測一種病原，多重PCR檢測方法在一次PCR反應中可同時檢測多種病原而明顯提高檢測效率。本研究旨在建立一種能同時檢測PEDV與TGEV的雙重RT-PCR檢測方法，并進行初步臨床檢測應用。

1 材料與方法

1.1 病毒模板與質粒

TGEV、PEDV、豬輪狀病毒(PRoV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等病毒模板和TGEV-M基因質粒與PEDV-M基因質粒為實驗室構建保存。

1.2 引物設計

針對PEDV(JQ023161)的M基因和TGEV(GQ374564)的M基因保守序列，用Premier 5.0軟件分別設計1對特異性引物，引物序列分別為PU：5′-CCCGTTGATGAGGTGATTGA-3′、PD：5′-GGATGCTGAAAGCGAAAAAG-3′(目的片段大小為229 bp)和TU：5′-GTGAGTCATGCTTCA ACGGAG-3′、TD：5′-GACACCAGTTGGCACACCTT-3′(目的片段大小為419 bp)。

1.3 單項PCR方法條件的篩選

用2×Taq MasterMix建立25 μL PCR反應體系，上、下游引物各10 pmol，DNA模板1.5 μL。PCR反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，35 cycles；72℃ 10 min。取8L PCR擴增產物通過20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。……