檢測小鼠血清3DAg-SERS基底制備及表征

(中南民族大學 化學與材料科學學院,湖北 武漢 430074)

表面增強拉曼光譜拉曼技術(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)[1]是通過化學或物理吸附方式將被檢測的目標物分子拉到基底表面,通過改變其極化率[2]或電磁場使被檢測物質的拉曼光譜得到明顯放大[3].對氨基苯硫酚作為農藥、醫藥、染料的中間體,檢測其殘留量有重要意義。現有檢測方法如電化學檢測法[4],此法檢測需進行樣品前處理、耗時長,敏度低。SERS檢測技術優勢在于樣品無需前處理可進行實時檢測且檢出限低至ng/L,應用在血清檢測重疾早期篩查、檢測、治療[5],提供新方法并有望提高檢測的靈敏度和效率。常規基底制作方法要用到光刻機、離子濺射器等價格昂貴的設備[6],不具有普適應,本實驗通過電化學陽極氧化-原位生長的方式制備出表面具有高密度hot-spots的SERS活性基底。實驗采用針灸針為固體基板,將其應用到小鼠血清樣品的檢測,采樣創口小可實時檢測最低可檢測出稀釋10-5倍血清樣品,以期可將此SERS基底運用到臨床取樣檢測的實際應用中。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

檸檬酸、氟化氨、硝酸鉀、硝酸銀、對氨基苯硫酚(4-ATP)乙二醇、乙醇(阿拉丁試劑公司)試劑均為分析純。單輸出直流電源(KPS-6005D深圳市兆信儀器有限公司),熱場發射掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社JSM-7800F型),拉曼光譜儀(美國賽默飛公司DXR2XI型)。

1.2 基底制備與表征

準備3支直徑0.3mm長度40mm一次性無菌針灸針，依次放入丙酮、甲醇、去離子水(電阻率>18.25MΩ)中超聲清洗,氮氣吹干。精密稱取0.12gNH4F,0.6g檸檬酸,溶解于25mL體積比9∶1的乙二醇去離子水溶液記為電解液A.直徑0.3mm鉑絲為對電極,針灸針為工作電極,直流電源施加恒壓50V。50min時取出去離子水清洗,氮氣吹干放入電解液B(3mmol/LAgNO3、3mmol/LKNO3、0.6mgFeCl3)中,負極為氧化后的針灸針正極為鉑絲電極電壓調至0.79V,電鍍時間20min、30min、40min、60min時取出,SEM進行表征、觀察形貌。SERS基底信號準確性:編號為1、2、3,SERS基底浸入5mL 10-6mol/L 4-ATP溶液自組裝30min,各隨機選取一點測試,實驗條件：He-Ne氣體激光器,激發光633nm,能量為1mw,激光照射3s,除去表面污染物,曝光時間0.05sec掃描次數為1次。SERS基底信號重現性:將1號取出,隨機選取5點,每點掃描3次并在1037～1104cm-1峰面積積分。

1.3 4-ATP檢測及小鼠血清檢測

精密稱取4-ATP 0.0125g,乙醇溶液配置成10-2mol/L儲存液,梯度稀釋.準備小鼠血清樣品記為C0,將其用去離子水(電阻率>18.25MΩ)依次釋成一系列濃度(C0×10-1,C0×10-2,C0×10-3,C0×10-4,C0×10-5)小鼠血清溶液,將制備完成的SERS基底與稀釋液自組裝30min。數據采集條件：激發光633nm,激光能量3mW,照射30s,曝光時間0.05sec掃描次數1次。

2 結果與討論

2.1 制備條件

不銹鋼針灸針氧化后,針體表面會形成5～20μm的氧化膜,此氧化膜表面的介孔可作為銀離子還原的生長位點[6]。在Ag+還原過程中，電解液中添加的少量Fe3+作為陰極去極化劑可避免析氫的極化作用。隨著時間的增加，陽極氧化過程不斷在加深。直至40min時可以明顯觀察到針灸針表面均勻的鋪滿一層介孔，這些介孔為后續Ag+的還原以及3D-AgNPS提供了良好的生長條件。故50min為陽極氧化的最佳條件。

為確定還原條件,將還原時間定位1h，因為硝酸銀溶液的濃度影響Ag(Ⅰ)還原的速度和量有關，改變硝酸銀溶液的濃度，并確定最佳生長條件。濃度為3mmol/L銀團簇的密度大且均勻，濃度過高會導致還原速度過快在基底上易形成塊狀結構，濃度過低會導致還原時間過長。故還原過程中選擇電解液濃度為3mmol/L的硝酸銀溶液為佳。

為確定最佳還原時間，硝酸銀濃度固定為3mmol/L，電鍍時間為變量0.5、1、1.5和2h。當還原時間為0.5h有少許銀納米顆粒生成，但密度較低。1h時大量的Ag+被還原成銀金屬且密度較高。電鍍時間過長Ag枝狀結構明顯增多直至成塊狀顆粒。圖1為陽極氧化時間50min還原時間(a)20min,(b)30min,(c)40min,(d)60min的SEM圖像。圖1(a),(b)有少許銀納米顆粒生成,密度較低。(c)還原時間40min,大量Ag+被還原成銀金屬,密度較高。電鍍時間過長Ag枝狀結構成塊狀顆粒(d),此結構非納米數量級,會導致金屬局域表面等離子共振[7]轉為表面等離子共振[8]使SERS基底活性降低,拉曼信號增強明顯下降，故采用1h為銀離子還原的最佳時間。

圖1 AgNO3濃度3mmol/L,氧化50min,還原(a)20min,(b)30min,(c)40min,(d)60min

2.2 信號準確性及重現性

4-ATP SERS圖譜中拉曼位移與文獻比對可知,1574 cm-1νC-C,1441cm-1、1391cm-1、1311cm-1的拉曼位移可分別歸于b2類型,νC-C+νC-H[8]、νC-C+δC-H[8]、νC-C+δC-H[8]的振動。1078cm-1由C-S鍵振動產生[9]受各種干擾較小,以1037～11104cm-1范圍峰面積為標準用以檢驗重現性。同一實驗條件,不同位置重復檢測,得樣品信號峰面積的相對標準偏差為2.74%,表明基底信號重現性良好。

2.3 4-ATP及小鼠血清檢測

圖2 不同濃度4-ATP SERS光譜圖

圖2顯示,SERS信號強度隨樣品濃度的降低而減弱,可證明SERS信號的強度與樣品本身的量有關。以1037～1104cm-1峰面積和樣品濃度數據進行分析得：4-ATP濃度在10-12～10-4mol/L圍內的線性方程為Y=5.124X-12.36,相關系數r=0.989線性關系良好,檢出限可低至10-12mol/L。

圖3 小鼠血清濃度為C0,C0×10-1,C0×10-2, C0×10-3,C0×10-4,C0×10-5SERS光譜圖

應用SERS手段檢測血清樣品時要特別注意：若激發樣品的能量過高則會引起熒光效應導致檢測信號過低或信號被熒光信號所覆蓋而檢測不到信號[10]。小鼠血清檢測過程中,未稀釋血清溶液為參考標準。逐級稀釋5份樣品與未稀釋樣品作為檢測對象,研究基底對于低濃度的小鼠血清溶液的檢測靈敏度。圖3所示,隨小鼠血清濃度降低,基底檢測樣品SERS信號減弱。如570cm-1,980cm-1,1000cm-1及1280cm-1隨著樣品稀釋倍數增加SERS信號強度明顯降低1600cm-1和1700cm-1波數位移隨著血清稀釋倍數增加逐漸歸于一個拉曼位移,當稀釋濃度為C0×10-5時1600cm-1和1700cm-1不再明顯。綜上所述,此基底可應用于檢測小鼠血清樣品,最低可檢測到原樣品稀釋10-5倍。

3 結論

本文采用電化學腐蝕-生長方法制備了不銹鋼針灸針

SERS活性基底。基底表面樹枝狀3DAgNPS結構為致密的Hotspots,提升了基底增信號的性能.此方法制備的SERS基底采集信號快速、準確且靈敏度高,可滿足直接檢測小鼠血清的要求且使用設備簡單、花費低、為制作微創SERS活性基底并應用于臨床取樣及檢測提供了新思路。