HPLC法測定保健食品中葉酸含量及穩定性研究

(浙江省醫學科學院，杭州 310013)

葉酸是一種重要的維生素，參與人體的許多生理活動，是維生素B復合體之一，最初從菠菜葉中提取純化，故命名為葉酸。葉酸為機體細胞生長和繁殖所必需的物質，與維生素B12一起促進了紅細胞的生成和成熟，是機體制造血紅細胞不可缺少的物質[1，2]，還參與幫助蛋白質代謝。葉酸的缺乏可以導致生理功能低下及某些疾病，如巨幼紅細胞貧血、智力退化、新生兒神經管畸形，白細胞減少癥等；葉酸對孕婦非常重要，孕婦補充足夠的葉酸，可防止新生兒嬰兒腭裂、體重過輕、早產癥狀。有研究表明在3歲以下的嬰兒食品中添加適量的葉酸，能對嬰幼兒神經與腦細胞發育有著很好的促進作用。葉酸的新作用被國內外一些學者慢慢發掘：治療慢性萎縮性胃炎、防止心肌勞傷及心肌梗塞、抗腫瘤等，使得葉酸成為維生素C、維生素E之后新崛起的一種保健維生素產品，其市場前景十分廣闊[3]。目前，葉酸的測定方法有主要有：微生物法[4]和色譜分析法[5-7]等，其中微生物法是經典方法，是國家標準方法，以其經典、準確可靠性為許多國際標準方法機構作為標準方法或第一法；但操作繁瑣，易受廣泛使用的抗生素影響，且是半定量法；色譜法實現了葉酸不同成分的分離，特異性高，已報道的高效液相色譜法檢測器分熒光和紫外2種[8-10]，熒光檢測器檢測靈敏度高, 但是需要衍生化處理, 過程繁瑣復雜[11-13]。中國藥典2015年版葉酸的測定采用的是高效液相紫外檢測器法[14]，處理較簡單，本實驗采用了中國藥典2015年版的方法對保健食品中葉酸進行檢測并對及其穩定性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(美國安捷倫)Agilent 1220 Infinity ；數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司) HH-4；葉酸標準品(純度：97%)；氨水(分析純)；甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)；供試品由浙江華方生命科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液∶甲醇=70∶30；檢測波長：280 nm;儀器流速：1.0 mL/min；儀器柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL。

1.2.2 標準溶液的制備

準確稱取24.15mg 葉酸(純度為97.0%)于25 mL棕色量瓶中，用0.5%氨水溶解并定容至刻度，搖勻即得0.9370 mg/mL濃度的葉酸對照品溶液。

1.2.3 樣品處理

準確稱取樣品1.0080 g置50 mL容量瓶中，加15 mL0.5%氨水75℃熱水浴20 min，時時振搖，冷卻，用水定容至刻度，搖勻后離心。用0.45 μm 微孔濾膜過濾，作為試液。

1.2.4 產品穩定性樣品處理

將樣品放在濕度為75%±5%，溫度為37 ℃左右的恒溫恒濕培養箱中分別放置1個月、2個月、3個月后，進行加速試驗后按1.2.3樣品處理后測定。

2 結果與討論

2.1 葉酸的HPLC色譜圖

分別取葉酸對照品、供試品各5 μL于高效液相色譜儀中測定，再根據葉酸的保留時間進行定性試驗，和外標法的峰面積進行定量試驗。結果葉酸對照品和供試品分別如圖1和圖2所示。

圖1 葉酸標準品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.2 標準曲線

準確吸取已配置好的葉酸標準溶液50 μL置于10mL棕色量瓶中，用水定容至刻度，搖勻即得4.685 μg/ mL 葉酸溶液濃度。然后分別準確吸取葉酸標準溶液50 μL、100 μL、200 μL、400 μL置于5 mL棕色量瓶中，和上述一樣處理最后得到系列濃度分別為4.685 μg/mL、9.370 μg/mL、18.740 μg/mL、37.480 μg/mL、74.960 μg/mL 的葉酸標準系列溶液。通過儀器設定好的條件自動進樣5 μL，測定出的峰面積以(Y)表示，溶液濃度以(X)表示，再進行線性回歸，計算出回歸方程為：Y=18.317X，r=1。結果表明：葉酸在4.685 μg/mL～74.960μg/mL內線性關系良好。

2.3 精密度

準確吸取標準系列下中間濃度值為18.74 μg/mL的對照品溶液5 μL，按照1.2.1項下色譜條件連續進樣9次，按峰面積計算葉酸的相對標準偏差(RSD)為0.53%(n=9)。

2. 4 重現性試驗

取同一批號樣品，按1.2.3項下方法制備6份樣品溶液，按照1.2.1色譜條件測定，得葉酸含量的RSD為2.2%(n=6)，表明方法的重現性良好。

2. 5 加標回收率

準確稱定9份樣品各1.0g左右，分別加入已知濃度的葉酸標準溶液，制備成相當于標示量的50%、80%、100%的模擬樣品，按1.2.3制備樣品并測定含量，計算樣品的加標回收率為94.8%～97.6%,平均回收率為96.0%，RSD為1.1%(表1)。

表1 加標回收率試驗結果

2.6 檢出限及定量限

以3倍信噪比(S/N) 計算得葉酸的檢出限為0.18 μg/mL。 以10倍信噪比(S/N) 計算得葉酸的定量限為0.60 μg/mL。

2.7 樣品加速破壞性試驗穩定性

在75%濕度、37℃的溫度條件下對保健食品進行了3個月加速破壞性試驗[15]，是對其在保質期內有效成分的穩定性進行考察，因此試驗將樣品放置恒溫恒濕0個月(放置前)、1個月、2個月、3個月后分別對3批加速試驗產品的樣品中葉酸含量進行了分析，結果表明樣品中葉酸含量平均下降比率為2.6%，說明樣品中葉酸的穩定性良好。

3 結論

利用HPLC法檢測保健品中的葉酸，該方法下葉酸在4.685 μg/mL～74.960μg/mL內線性關系良好，精密度良好即相對標準偏差(RSD)為0.53%(n=9)，重現性實驗葉酸含量的RSD為2.2%(n=6)，表明方法的重現性良好準確，可用于保健食品中葉酸質量控制，同時保健食品中的葉酸經過3個月加速試驗，樣品中葉酸含量平均下降比率為2.6%，結果表明含量變化不大，穩定性良好。