應用液相色譜-原子熒光聯用儀測定富硒大米中的5種硒形態

(杭州市食品藥品檢驗研究院，杭州 310022)

1 引言

硒，作為人體必須要的微量元素之一，它的形態結構及功能越來越受到廣大人民的關注。21世紀隨著人民生活水平的提高，人們越來越注重養生，各種保健品，營養添加劑，各種輔食都被研發出來滿足人民生活需要，但是并不是說補的越多越好，也不是說任何形態的硒都能補[1]。硒元素在能被人體吸收的主要是有機硒，補硒能抗癌，抗氧化，提高免疫力，降低大骨節病與克山病的發病率。硒與人體合成紅細胞谷胱甘肽過氧化物酶(RBC GSH-PX)、磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶(PHG-PX)、血漿谷胱甘肽過氧化物酶(PGSH-PX) 等都有密不可分的關系。硒還參與甲狀腺激素平衡，調控胰島素介導的代謝作用，磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx,也是一種硒蛋白)受促性腺激素的調節,參與精子的成熟等[2]。自然界中硒主要以無機硒的形式存在，但是無機硒不易吸收，而且人體攝入無機硒是有毒的。有機硒易吸收，但是產量低，價格高，易存在摻假牟取暴利。同時，硒攝入過多會引起硒中毒，導致脫發，掉指甲，無力等癥狀。因此合理開發利用硒，其重要意義在于保證富硒產品生產過程的安全。存在于食品中硒，有很多種形態，常見的化學形態為硒酸鹽(SeVI)、亞硒酸鹽(SeIV)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒代乙硫氨酸(SeEt)、三甲基硒(TMSe)、硒脲(SeUr) 等[3，4]。無法對有機硒的存在形態進行定性以及定量分析的原因在于現行有效的食品安全國家標準測定結果，一般包括測定無機硒在內的硒元素總量。目前，在食品安全國家標準缺乏的情況下，針對富硒農產品的甄別以及食品安全監測的情況，盡快開發更快、更準確地分析農產品中的各種硒形態的檢測方法，具有重要意義。

目前，在歷年文獻中出現有機硒形態檢測方法，包括有離子色譜-積分脈沖安培檢測法、高效液相色譜法、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP/MS)、液相色譜-原子熒光光譜法及其他聯用技術[5-14]，其中HPLC-ICP/MS 儀器設備昂貴、運行成本高,不利于推廣應用。高效液相色譜-原子熒光聯用或高效液相色譜-質譜聯用技術是現在有機硒形態分析的主流方法，由此本實驗建立了高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜聯用技術(high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry, HPLC-HGAFS)檢測5種硒形態的方法，該方法具有以下優點：原理簡單、實驗操作快速、結果準確，儀器性價比高，易推廣及應用。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

AFS-933/ASP-20原子熒光形態分析儀(北京吉天儀器有限公司)；硒原子熒光空心陰極燈(北京有色金屬研究總院) ；AP-9925無油真空泵(天津奧特賽恩斯)；KQ-250E超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Neofuge 15R臺式高速離心機(上海力申科學儀器有限公司)。

氫氧化鈉(天津市光復科技有限公司)；硼氫化鉀(阿拉丁)、磷酸氫二胺(GR 天津市科密歐化學試劑有限公司)；四丁基溴化銨(麥克林)、甲醇(色譜純J.T.BaKer)、鹽酸(GR 永華化學科技(江蘇)有限公司)；鏈霉蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)；脂肪酶(瑪雅試劑)、淀粉酶(上海安普科學儀器有限公司)；氨水(AR杭州龍山精細化工有限公司)；甲酸(AR上海凌峰化學試劑有限公司)；97.9μg/g硒代蛋氨酸溶液標準物質GBW 10034、68.9μg/g亞硒酸根溶液標準物質GBW 10032、93.5μg/g硒代胱氨酸溶液標準物質GBW 10087、75.1μg/g硒酸根溶液標準物質GBW 10033(中國計量科學研究院)；Se-甲基硒代-L-半胱氨酸(純度98% 北京百靈威科技有限公司)；實驗用水均為實驗室超純水。

2.2 標準溶液的配置

分別準確吸取1.13mL、1.27mL、1.166mL、1.204mL硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、亞硒酸根、硒酸根于10mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，得濃度為5mg/L(以硒計)的標準儲備溶液。準確稱取Se-甲基硒代-L-半胱氨酸23mg于100mL容量瓶中加入1mL鹽酸，用超純水定容至100mL，得100mg/L(以硒計)標準儲備液。儲存在0～4℃冰箱中。

使用前取不同體積的標準儲備溶液置于10mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，混勻，得到一系列標準工作液，濃度分別為10、30、50、100、200μg/L。

2.3 樣品處理

取一定量的富硒稻米試樣進行粉碎、混勻，過0.850mm孔徑篩，稱取0.1g(精確至0.001g)富硒稻米樣品于10mL離心管中，稱取10mg鏈霉蛋白酶E溶于3mL超純水，渦旋混勻，置于超聲清洗器中，于水溫37℃，60min超聲提取。待提取結束后，于8000r/min離心20min，吸取上清液，過0.22μm的有機濾膜，然后上機進行檢測，同時做樣品空白。

2.4 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱(C18，5μm，100?.4.6×150mm，海光儀器)；預柱(C18,5μm，100?.4.6×10mm，海光儀器)；柱溫箱溫度30℃；流動相為30mmol/L磷酸氫二銨+0.5mmol/L四丁基溴化銨+2%甲醇，用甲酸調節pH至5.8～6.0；流速為1.0mL/min；進樣量為100μL；分析時間為10min。

氫化物發生器條件：載流：10%HCL；還原劑：2%KBH4+0.35%NaOH；氧化劑：0.1%KI+0.35%NaOH；蠕動泵轉速為65r/min。

原子熒光檢測條件：硒空心陰極燈，燈總電流90mA；輔陰極電流45mA；載氣屏蔽氣為氬氣，流量為300mL/min；屏蔽氣流量為600mL/min；光電倍增管負高壓為300V，原子化器高度為8mm。

3 結果與分析

3.1 儀器條件優化

3.1.1 流動相的選擇

流動相的選擇對目標化合物的分離及其重要，根據文獻報道，考慮到硒5個形態的分離效果和靈敏度，當用磷酸氫二銨時，適當調節pH，加入四丁基溴化銨與甲醇提高分離度與靈敏度時效果最好。磷酸二氫銨中不加四丁基溴化銨是會使Se-甲基硒代-L-半胱氨酸與亞硒酸根無法分離且靈敏度降低。因此本實驗采用的流動相為30mmol/L磷酸氫二銨+0.5mmol/L四丁基溴化銨+2%甲醇。

3.1.2 流動相pH的選擇

pH不同時硒形態在水溶液中表現出不同的離子狀態，因此流動相的pH對結果影響很大。本研究考察了磷酸氫二銨為流動相時pH4、5、5.5、6、6.5時硒形態的分離效果。結果表明：當pH為4時，亞硒酸根與硒代蛋氨酸重合，且所有峰都有毛刺；當pH為5時，5個峰均已明顯分離，但是峰還是有很大的毛刺；當pH為5.5～6時峰均已達到基線分離，且峰均平滑；當pH 越低時，Se-甲基硒代-L-半胱氨酸靈敏度越高，硒酸根靈敏度越低，保留時間越長；當pH為6.5時，硒代胱氨酸靈敏度降低，Se-甲基硒代-L-半胱氨酸與亞硒酸根有部分重合；pH 上升時硒酸根靈敏度上升，亞硒酸根靈敏度上升。因此，綜合各方面考慮本研究選擇pH6.0作為流動相酸度。

3.1.3 流動相濃度的選擇

本實驗探討了20、30、40mmol/L的磷酸氫二銨溶液(pH6.0)對5種硒形態分分離效果的影響。實驗結果表明：當磷酸氫二銨溶液(pH6.0)濃度為20mmol/L時，硒酸根保留時間延長，亞硒酸根與硒代蛋氨酸重合；當磷酸氫二銨溶液(pH6.0)濃度為30mmol/L時，可以達到基線分離；當磷酸氫二銨溶液(pH6.0)濃度為40mmol/L時，硒酸根保留時間縮短，但是硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒代蛋氨酸重合。因此本研究采用30mmol/L的磷酸氫二銨作為流動相，此條件下，5種硒形態分離效果最好。

3.1.4 流動相流速的選擇

流速對硒形態的分離效果也有很大影響，本研究考察了流速為0.5、0.8、1.0、1.2mL/min的磷酸氫二銨(pH6.0)時分離效果。當流速為0.5mL/min時峰有毛刺、不圓滑。當流速為0.8mL/min時峰也有毛刺。當流速為1.0mL/min時，可以達到基線分離，峰圓滑。當流速為1.2mL/min時出峰時間短但是峰達不到基線分離。因此本實驗采用流速為1.0mL/min分離效果最佳。

3.2 提取條件的優化

富硒食品中的硒的存在形態大多以硒代蛋白的形式存在。本實驗以SeMet 陽性樣品( 通過噴施亞硒酸鹽種植出的水稻，即通過生物轉化方式實現無機硒向有機硒的轉化)由廣西大學資源與環境學院提供(總硒含量3.25mg/kg)。因此實驗主要優化了鏈酶蛋白酶E不同提取時間、提取方式對樣品中形態的提取效果。通過考察鏈酶蛋白酶E于37℃超聲提取15、30、45、60min，結果表明：當15 min超聲提取時，未提取完全；當提取時間設置為45 min 和60 min 時，提取效率均達到較高值，考慮到硒形態特別是硒代胱氨酸穩定性差[15]，本實驗選用超聲時間為45 min。

3.3 保留時間和檢出限

按照材料與方法的操作對5種硒形態系列標準溶液進行測定，實驗結果表明：5種硒形態在10～200μg/L范圍內的線性相關性較好，檢出限在2.27～3.89μg/L之間，結果見表1，標準液相色譜圖見圖1。

表1 5 種硒形態的保留時間、線性方程、相關系數和檢出限

圖1 5種硒形態標準溶液色譜圖(100 μg /L)

3.4 加標回收實驗

選取另一種硒含量不同的富硒大米(總硒測定結果為1.25 mg/kg)作為實驗樣品, 測此樣品各種形態的硒本底值, 再進行加標回收實驗, 分別對3 個濃度進行添加回收, 每個濃度6 個平行實驗結果表明：5 種硒形態的加標回收率在85.4%～105.5%之間, 相對標準偏差均小于5.8%。結果見表2。

表2 大米中硒形態的加標回收率(n=6)

3.5 樣品測定

應用本研究所建立的方法測定了噴施了硒肥的富硒大米試樣中的有機硒形態，檢測結果發現：在富硒大米中，僅存在硒代蛋氨酸含量(以硒計)一種形態的有機硒。

4 結論

建立了高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜聯用技術(high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry, HPLC-HG-AFS)檢測富硒大米中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根等5 種硒形態的方法。樣品采用鏈酶蛋白酶E水解超聲提取的方式，30mmol/L磷酸氫二銨+0.5mmol/L四丁基溴化銨+2%甲醇為流動相，用甲酸調節pH至5.8～6.0，經C18(5μm，100?.4.6×150mm)色譜柱分離后HG-AFS 測定，10min內5種硒形態可以完全分離。各種硒形態標準曲線線性相關系數(r)均大于0.995, 方法檢出限為2.27～3.89 μg/L。5種硒形態回收率在85.4%～105.5%之間。實驗所建立的方法不僅可以對大米中硒的5 種形態快速、準確地進行定性和定量分析,而且有助于對市場上魚龍混雜的富硒大米產品進行真偽鑒別和品質甄別，對開展食品安全風險監測、評估具有重要意義。