超高效液相色譜-串聯質譜法分析沿海貝類產品中的麻痹性貝毒

(1.浙江省海洋水產研究所，水產品加工與質量安全研究室，舟山316021;2.浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州 310035;3.浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，農業部重點漁場漁業資源科學觀測實驗站，舟山316021;4.浙江海洋大學食品與醫藥學院，舟山 316022))

麻痹性貝毒(paralytic shellfish poisonings，PSP)是由海洋中貝類通過非選擇性濾食有毒海藻或其孢子，經食物鏈蓄積、轉化生成的一類四氫嘌呤衍生物[1]。在多種貝類毒素中，PSP危害最大、發生頻率最高、分布范圍最廣，嚴重威脅人類健康[2]。聯合國衛生組織規定貝類可食用部分的PSP含量不得超過800μg STXeq/kg[3]。

目前PSP測定方法主要有小鼠生物法、ELISA法、細胞毒性測試法、毛細管電泳法[4]、液相色譜法[5]和液質聯用法[6]。小鼠生物法無法定量毒素組分，ELISA法易產生假陽性，細胞毒性測試法難以迅速普及，毛細管電泳法適用性有限，液相色譜法前處理復雜。液質聯用法可同時提供定性定量信息，已廣泛應用于動物及環境中PSP的監測。本研究以超高效液相色譜-串聯質譜法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)為分析手段，對沿海省份6類共99批次貝類產品中13種PSP進行了監測，為了解PSP在食用貝類中的污染和分布情況提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扇貝、貽貝、牡蠣等貝類產品，購買于沿海各省市的流通市場和養殖區；PSP標準品購買于加拿大海洋生物科學研究所；乙酸：優級純，上海國藥集團；氨水：色譜純，上海沃凱生物技術有限公司；乙腈：色譜純，德國Meker公司；甲酸：色譜純，上海國藥集團。

1.2 儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜-質譜儀(美國Water公司)；石墨化碳黑固相萃取柱(250mg/3mL，美國Supelco公司)；Centrifuge5810高速離心機(德國Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品前處理參考文獻[7]：稱取5g均質試樣于50mL離心管中，加入5mL1%乙酸水溶液，渦旋混合90s，密封置于沸水浴5min，取出于流水冷卻至室溫?；旌衔?500r/min離心10min，取上清液1mL于2mL離心管中，加入5μL氨水，渦旋混勻后10000r/min離心5min。

依次用3mL乙腈、3mL20%乙腈水溶液(含1%乙酸)、3mL0.1%氨水溶液活化石墨化碳黑固相萃取柱，500μL提取液上樣，700μL超純水淋洗，最后用1mL75%乙腈水溶液(含0.25%甲酸)洗脫收集于2mL離心管中。洗脫液過0.22μm濾膜于進樣小瓶中，4°C下保存，供UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH Amide(2.1×100mm，1.7μm)；流動相A：水/甲酸/氨水(500:0.075:0.3，v/v/v)，流動相B：乙腈/水/甲酸(700:300:0.1，v/v/v)；梯度洗脫程序：0～2.0min，4%A；2.0～4.0min，4～30%A；4.2～6.0min，30～65%A；6.2～8.0min，65～4%A；柱溫40℃；樣品溫度4℃；進樣體積10μL；流速0.4mL/min。

1.3.3 質譜條件

質譜條件：電噴霧離子(ESI)，多反應監測(MRM)，正負離子切換模式；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度600℃；脫溶劑氣流量1000L/h；錐孔氣流量150L/h。其中STX、NEO、dcSTX、dcNEO采用ESI+，毛細管電壓1.0kV，錐孔電壓10V；其他目標物采用ESI-，毛細管電壓2.7kV；錐孔電壓40V；定性、定量離子對及其他參數見表1。

表1 麻痹性貝毒質譜參數

續表1

1.4 毒性轉換

STX毒素的毒性因子設為1，其他各種毒素按照毒性因子，統一轉換為STXeq來表示，計算公式為：

式中：Xi，各種PSP的含量，μg/kg；ri，毒性因子。麻痹性貝毒毒性因子見表2。

表2 麻痹性貝毒毒性因子

2 結果與分析

2.1 超高效液相色譜-串聯質譜法

PSP屬于強極性化合物，其中C1與C2、GTX1與GTX4、GTX2與GTX3、dcGTX2與dcGTX3互為同分異構體。本法前處理參考吳海燕等[7]，樣品采用1%乙酸水溶液提取、石墨化碳黑固相萃取柱凈化；但目標物經氨基柱分離，MRM模式檢測。吳海燕采用TSK柱對PSP進行洗脫，保留時間在5.85到6.17min之間；本文利用流動相的酸堿度變化，結合梯度洗脫，可在8min內實現13種PSP的有效分離，保留時間在1.97到4.74min之間，具有可比性。

方法采用空白基質制作標準曲線，13種目標物在4～722ng/mL線性范圍內相關系數均大于0.996，檢出限為4～14μg/kg。方法回收率為60～105%，日內和日間相對標準偏差(RSD)分別為3～16%和5～17%(n=3)。本方法靈敏度、回收率與精密度良好，適用于各種貝類產品中PSP的檢測(表3)。

表3 麻痹性貝毒方法學參數

續表3

2.2 沿海貝類中麻痹性貝毒的監測情況

對沿海六省一市采集的99批次貝類產品進行分析，共檢出PSP陽性樣品17批次(圖1)，分布于浙江、江蘇、遼寧三省，其檢出率分別為46.67%、35.71%、33.33%。孫燁[8]統計2000～2015年PSP食品中毒事件，發現浙江省中毒案列高于其他各省，與本結果基本相符。

比較采樣時間(圖2)對PSP檢出率的影響，發現6月檢出率高達68.75%，7月和9月檢出率在18.75%～21.43%間。夏秋兩季是赤潮的高發季節，貝類濾食有毒藻類的幾率增加，PSP檢出率隨之增加。本次調查的貝類產品覆蓋面廣，采集時間較為分散，后期應合理增加采樣頻次，以便全面評價不同貝類中PSP的安全風險。

圖1 各省份貝類產品中麻痹性貝毒的檢出情況

圖2 各采集時間貝類產品中麻痹性貝毒的檢出情況

圖3 不同品種貝類產品中麻痹性貝毒的檢出情況

由圖3可見，6種貝類產品中共有4種貝類產品中有PSP檢出，貽貝、泥蚶、毛蚶、扇貝檢出率依次降低，分別為38.89%、23.53%、23.08%、16.67%。如表4所示，17批次陽性貝類的PSP含量在66.9～1635.5μg STXeq/kg之間，其中3批次泥蚶的PSP含量超過了聯合國衛生組織的安全限值。圖4為陽性泥蚶樣品和混合標準品中13種PSP的定量MRM色譜圖。

表4 陽性貝類樣品中的麻痹性貝毒含量

續表4

圖4 (A)陽性泥蚶樣品和(B)混合標準品中麻痹性貝毒的MRM色譜圖

2.2 陽性貝類中麻痹性貝毒的分布情況

PSP中STX毒性最高，其他多種毒素均通過轉換成STX當量來表示；NEO的毒力僅次于STX，這兩種毒素是PSP監測的重要指標[9]。本次監測發現在13種PSP中STX、GTX5和dcSTX的檢出率較高，分別達到82%、71%和71%，而NEO的檢出率為41%，與之前文獻報道基本一致[9，10]。

通過毒性轉化公式將陽性樣品中的各毒素統一轉換為STXeq，并計算其在總毒素(∑STXeq)中所占的百分比(圖5)。從毒素組成分析來看，陽性毛蚶中PSP主要以STX(58～88%)形式存在，還有少量的dcGTX3、GTX5和GTX3(均<5%)；其中2批次樣品還含有一定量的dcSTX(11%和36%)。陽性泥蚶中PSP主要以dcSTX(43～75%)、STX(12-22%)為主，此外還含有微量的C1、C2(均<7%)；其中有2批次含有少量GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX3(均<10%)。陽性扇貝中PSP以GTX5(31～38%)、STX(34～38%)為主要存在形式，同時含有微量dcSTX(均<6%)；其中2批次樣品中GTX4的含量分別達到21%和25%。

在7批次的陽性貽貝中，PSP存在形式差異較大，其中1批次樣品僅含有C1一種毒素；1批次樣品含有STX(50%)、GTX1(29%)、NEO(18%)及微量GTX2(3%)；2批次樣品特征相似，主要以C2(25%和26%)、dcSTX(24和25%)和NEO(20%和25%)為主，此外還含有微量GTX2、GTX5、dcGTX3、STX(3-9%)；1批次樣品主要含NEO(30%)、GTX3(20%)、dcSTX(18%)和dcGTX3(10%)，及微量C1、GTX2、GTX5、STX(2～8%)；1批次樣品以NEO(67%)和GTX3(15%)為主，同時有少量C1、GTX2、GTX5(總比<18%)；1批次樣品主要以dcGTX3(28%)、C1(25%)、GTX1(23%)、GTX5(19%)形式存在，及少量dcGTX2(5%)。

圖5 陽性貝類樣品中麻痹性貝毒分布情況

3 結論

采用UPLC-MS/MS方法進行了沿海貝類產品中13種PSP的定性定量分析，本方法靈敏度高、分析速度快、重現性好，可廣泛適用于各類貝類產品中麻痹性貝毒的檢測。