UPLC-MS/MS法分析大鼠血清中二仙湯5種抗骨質疏松成分含量

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(1. 浙江大學化學系，杭州 310007；2. 浙江省中醫(yī)藥研究院，杭州 310007)

骨質疏松癥是一種以骨量降低、骨組織顯微結構破壞、易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性疾病[1]。中醫(yī)將骨質疏松歸于“骨痛”與“骨痿”等范疇，常以補腎方劑治療。二仙湯由仙茅、淫羊藿、巴戟天、當歸、黃柏及知母六味中藥組成[4，5]，是治療骨質疏松癥的名方，對于骨質疏松患者及骨質疏松模型動物的骨密度、骨小梁厚度等指標有改善作用[6，7]，增強體外培養(yǎng)成骨細胞增殖及骨形成能力[8]。目前對二仙湯的研究多集中于藥理機制，尚未見到報道考察二仙湯在動物體內(nèi)血藥濃度的研究。

二仙湯的主要成分為仙茅苷、淫羊藿苷、小檗堿、阿魏酸、知母皂苷BII。藥理研究顯示仙茅苷具有清除氧自由基，增強免疫作用，延緩生殖系統(tǒng)老化，抗骨質疏松，保護心血管系統(tǒng)等作用。淫羊藿苷提取自淫羊藿的干燥莖葉，為淫羊藿的主要有效成分。屬黃酮類化合物。體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷具有顯著的抗炎、抗氧化、及促進成骨細胞增殖作用[9]。小檗堿是屬于異喹啉類生物堿，是中藥黃柏的主要生物堿之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿及其衍生物在治療炎癥、腫瘤、糖尿病、阿爾茨海默病等方面具有藥理作用，且可以抑制破骨細胞活性達到抗骨質疏松作用。阿魏酸是從當歸中提取出來的有效成分，有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)及促進成骨細胞增殖等作用。研究表明[10]，知母皂苷BⅡ能明顯降低四氧嘧啶誘導的糖尿病大鼠的血糖水平，提高去卵巢大鼠骨密度，發(fā)揮抗骨質疏松活性。

超高效液相色譜-三重四級桿質譜(UPLC-MS/MS)法能夠從復雜樣品中明確目標物，大大提高了生物樣品檢測的靈敏度和專一性，是目前測定藥物成分含量最有效的方法之一。因此本工作采用UPLC-MS/MS方法研究二仙湯含藥血清中有效成分的含量，為該方劑的現(xiàn)代化研究提供實驗基礎。

1 試驗部分

1.1 儀器及試劑

Waters Xevo TQD型超高效四極桿質譜，電噴霧(ESI)離子源，Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀；Millipore純水機；METTLER AE-50天平；Microfuge 20R高速離心機； IKA Lab Dancer多用途渦旋混合器。

對照品：淫羊藿苷(批號：489-32-7)、知母皂苷BII(批號：16041602)、仙茅苷(批號：85643-19-2)、小檗堿(批號：15010411)均購自于北京世紀奧科生物技術有限公司；阿魏酸(批號：110773-200611)由中國藥品生物制品檢定所提供；HPLC級甲醇和乙腈購自默克(Darmstadt，德國)；水為自制雙蒸水，其余試劑均為分析純；全部溶劑均采用0.22μm微孔濾膜過濾。

1.2 儀器工作條件

(1) 色譜條件：分析柱：ACQUITY UPLC BEH C18；流動相A：水，流動相B：乙腈；線性梯度洗脫，洗脫流程為：0～3min，10%B；8min，25%B；11min，35%B；14min，45%B；17min，55%B；18～28min，95%B；28.2～30min，10%B；柱溫：30℃；流速：0.4mL/min；進樣體積：5μL。

(2) 質譜條件：電噴霧電離(ESI+/ESI-)；質譜掃描方式：多反應檢測(MRM)；脫溶劑氣：氮氣；碰撞氣：氬氣；干燥氣流量：10L/min；干燥氣溫度：350℃；霧化氣：35psi；錐孔電壓：35℃。其他質譜條件見表1。

表1 質譜條件

1.3 試驗方法

(1) 對照品的配制：精密稱取淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷、阿魏酸、小檗堿0.5 mg溶于空水，溶解均勻，配制成100 mg/L儲備液。精密吸取淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷、阿魏酸、小檗堿儲備液適量，配制為系列濃度的工作溶液。儲備液與工作液經(jīng)0.45μm微孔膜過濾，備用。

(2) 二仙湯水提物的制備：分別取9g淫羊藿、9g仙茅、9g巴戟天、9g當歸、6g知母、6g黃柏，先雙蒸水浸潤30min，后熱水回流提取40min，反復煎煮3次，最后將3次藥液合并，濃縮至成為二仙湯提取液(2g生藥/mL)。

(3) 血清樣本的制備：取雄性大鼠10只，每組5只，共兩組，即空白組、全方組，連續(xù)喂養(yǎng)并給藥4周，于第四周周末禁食12h(自由飲水)，按照2mg/100g體質量，分別灌胃給予蒸餾水、二仙湯的灌胃藥液，給藥2h后，用10%水合氯醛麻痹并經(jīng)肛門靜脈取血5mL，血液3000rpm條件下離心10min，取上清液1mL，加入0.6mL6%高氯酸，快速搖勻，3000rpm條件下離心10min，取上清液過0.45μm微孔濾膜，備以HPLC分析。

2 結果與討論

2.1 線性范圍及最低檢測限

精密吸取淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷、阿魏酸、小檗堿儲備液適量，取適量空白血清加入，配制為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/L濃度的工作溶液。每一濃度6份，按“1.2項”下UPLC-MS/MS條件進行測定，色譜圖如圖1所示。以淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷、阿魏酸、小檗堿的濃度X與其峰面積Y作線性回歸，得到線性回歸方程和相關系數(shù)，并以信噪比(S/N)≥3的濃度測得檢出限，結果見表2。

表2 指標成分的回歸方程、相關系數(shù)(r)及檢出限

圖1 二仙湯5種有效成分的色譜圖

2.2 樣品含量測定

10只大鼠灌胃給藥2h后，進行UPLC-MS/MS分析。結果見表3。其中在血清中發(fā)現(xiàn)了淫羊藿苷、知母皂苷BII以仙茅苷，含量范圍是在0.19～0.80mg/L。文獻報道[11]，阿魏酸和小檗堿的口服吸收較差,生物利用度較低，本工作在大鼠血清中未檢出阿魏酸和小檗堿。

表3 大鼠灌胃2h后血清中各化合物濃度

注：ND表示未測得。

3 結論

通過UPLC-MS/MS法測定二仙湯中抗骨質疏松成分，并將其對大鼠口腔灌胃，大鼠血清中檢測到淫羊藿苷、知母皂苷BII和仙茅苷，阿魏酸和小檗堿未檢出，與化合物在動物體內(nèi)生物利用度低有關。本研究所建立的超高效液相色譜串聯(lián)質譜法測定血清中二仙湯抗骨質疏松成分含量測定方法簡便、快速、靈敏、準確，能滿足臨床中藥制劑中指標成分在生物樣本中含量測定，為中藥代謝組學，藥動學和藥效學研究提供科學的依據(jù)。