超高效液相色譜法測定中華絨螯蟹的膽固醇含量

(1.中國水產科學研究院農業部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.浙江省海洋水產研究所，浙江海洋大學海洋與漁業研究所，舟山 316021)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹或大閘蟹，隸屬于節肢動物門，甲殼綱，十足目，方蟹科，弓腿亞科，絨鰲蟹屬。中華絨螯蟹的生存適應能力很強，廣泛分布在北起遼河、南至珠江的淡水水域，是我國重要的水產養殖經濟蟹類，在我國水產養殖業中占據十分重要的地位[1]。近幾年，我國的河蟹養殖年產量均在60萬噸以上，是世界最大養殖國，年產值逾400億元[2]。河蟹營養價值較高，其中脂類是其主要營養成分之一，不但為河蟹生長提供能量[3]，且對蟹可食部分營養品質和風味起著關鍵性的作用[4]。

河蟹脂類包括甘油三酯、游離脂肪酸、磷脂和膽固醇等成分，其中，膽固醇是動物組織細胞所不可缺少的重要物質，它不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸、維生素D以及甾體激素的原料[5,6]。但是，膽固醇含量過高易導致高脂血癥、動脈粥樣硬化，進而誘發一系列心腦血管疾病，所以飲食中膽固醇的攝入量需要控制[7,8]。因此，河蟹是一種膽固醇含量較高的食品，因此，對其快速準確定量對保證人體健康是具有一定意義的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華絨螯蟹，2017年9月取自固城湖、遼河、陽澄湖、黃河等產地；膽固醇標準品，美國Sigma公司；色譜純甲醇，德國Merck公司；其他試劑，如無水乙醇，氫氧化鉀，冰醋酸均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀ACQUITY UPLC系統，美國Waters公司；Avanti JXN-30型冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；MS-3型圓周振蕩器，德國IKA公司；HH-S11-6型水浴鍋，常州金壇精達儀器制造有限公司。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取膽固醇標準品0.05 g，用無水乙醇定容至50 mL，濃度為1mg/mL，密封后于冰箱中4 ℃下保存備用。臨用前，用無水乙醇稀釋上述標準儲備液，配制成濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、200 μg/mL的標準工作液。以標準溶液濃度對應峰面積繪制標準曲線，用于外標法定量。

1.4 樣品前處理方法

參考Albuquerque等人方法[9]略作修改。稱取中華絨螯蟹1.00 g蟹黃(蟹膏)樣品或3.00 g蟹肉樣品于離心管中，加入15.0mL無水乙醇和5.0 mL不同濃度的氫氧化鉀溶液(10 M)混勻，渦旋振蕩30 s。隨后，將試樣置于90℃水浴鍋中恒溫水浴0.5h。皂化結束后，取出離心管冷卻至室溫，用冰醋酸將樣品調至中性，于5000g條件下離心5 min，取上清液，再用無水乙醇定容到50.0mL。取1mL定容好的溶液，過0.22μm濾膜，進行UPLC檢測，采用外標法定量。

1.5 UPLC條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7 μm, 2.1 mm × 100 mm)；柱溫：38 ℃；流動相：甲醇；流速：0.2 mL/min；檢測波長：205 nm，進樣量：1.0～10.0μL。

1.6 統計分析

UPLC測定膽固醇方法的標準曲線、精密度和準確度實驗均重復6次。其余所有實驗重復3次，結果表示為平均值± 標準偏差。實驗數據采用SPSS進行t檢驗和多重Duncan比較，p< 0.05表示差異顯著，p< 0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 UPLC進樣體積的選擇

本研究的色譜條件參考自GB 5009.128—2016的HPLC條件[10]，考慮到BEH C18柱(長度100 mm)的柱容量，實驗選用了濃度為50μg/mL膽固醇標準液進行了進樣實驗，結果如圖1所示。在流速0.2 mL/min條件下，當進樣量體積在5 μL以下時，呈現較好的對稱峰。當進樣量體積超過5 μL，出現分叉峰。隨后固定進樣體積5 μL，選用濃度5、10、25和200 μg/mL膽固醇標準液進樣，結果如圖2所示。在所試濃度下，所有的膽固醇目標峰峰形對稱。本研究結果與Ahn等人研究相似，該小組在相同色譜柱、流動相甲醇/乙醇/水(45/45/10，v/v/v)，流速0.3 mL/min條件下，發現當進樣量超過4 μL，對稱峰形消失，分叉峰出現[11]。綜上，本研究選用的最優進樣量為5 μL。

圖1 不同進樣體積的膽固醇標準品(50 μg/mL)色譜圖

圖2 不同濃度膽固醇標準品進樣5 μL的色譜圖

2.2 標準曲線、檢出限和定量限

本研究按1.5色譜條件和優化得到的5μL進樣量，以膽固醇質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，重復6次。按3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)，10倍信噪比計算方法的定量限(10S/N)，相關結果如表1所示。實驗結果表明，在膽固醇濃度范圍5～200 μg/mL內，標準曲線斜率平均值為22273，相對標準偏差(RSD)為0.79%；截距為13889，RSD為41.7%；確定系數R2平均值為0.9999，表明線性良好。檢出限(LOD)為0.9μg/mL，定量限(LOQ)為2.0μg/mL，表明可滿足中華絨螯蟹膽固醇的檢測分析。

表1 UPLC測定膽固醇的線性度，檢出限和定量限

2.3 準確度和精密度

在不同中華絨螯蟹樣品中通過添加不同濃度的膽固醇標準溶液進行回收率實驗，同時相同加標濃度樣品重復6次，通過RSD評價UPLC測定方法的精密度(表2)。結果表明，在20、40、50、300mg/100g加標水平下，膽固醇在不同中華絨螯蟹樣品的回收率波動較小，平均值范圍為80.5～92.6%，結果準確度較高。同一中華絨螯蟹樣品回收率的RSD范圍為0.45～3.1%，均小于5%，表明UPLC測定中華絨螯蟹膽固醇方法的精密度良好。

表2 中華絨螯蟹膽固醇測定的回收率和精密度

2.4 中華絨螯蟹樣品膽固醇含量分析

按照本研究建立好的UPLC測定方法，對中華絨螯蟹不同部位(圖3)及不同產地(圖4)的膽固醇含量進行了分析。如圖3所示，中華絨螯蟹的不同部位膽固醇含量具有差異性。其中，蟹黃和蟹膏的膽固醇含量分別為214±57 mg/100g和194±82 mg/100g，兩者之間無顯著性差異(p> 0.05)，但均極顯著高于肌肉的膽固醇含量(p< 0.01)。此外，中華絨螯蟹雄蟹肌肉(38.9±5.8 mg/100g)與雌蟹肌肉(40.1±5.0 mg/100g)之間的膽固醇含量無顯著性差異(p> 0.05)。楊志剛等人研究了餌料對中華絨螯蟹雄蟹可食部分營養成分的影響，結果發現，肝胰腺和性腺所含膽固醇高于肌肉組織[4]。

如圖4所示，不同產地的中華絨螯蟹的膽固醇含量也具有差異性?？傮w上看，產自陽澄湖和固城湖的中華絨螯蟹的膽固醇含量分別為154±115 mg/100g和152± 117 mg/100g，稍高于黃河(83.6±55.7mg/100g)和遼河(97.1 ± 67.8mg/100g)，但差異不顯著(p> 0.05)。詳細來看，陽澄湖中華絨螯蟹蟹肉的膽固醇含量最高，為44.2±5.3 mg/100g，顯著高于其余3組(p< 0.05)，而遼河中華絨螯蟹蟹肉的膽固醇含量是最低的，為34.2±3.8mg/100g，極顯著低于其余三組(p< 0.01)。陽澄湖和固城湖樣品的蟹黃及蟹膏的膽固醇總量分別為264±29mg/100g和264 ±28mg/100g，均顯著高于黃河和遼河的中華絨螯蟹樣品(p< 0.05)；黃河中華絨螯蟹的蟹黃及蟹膏膽固醇總量最低，為128 ±47mg/100g，均顯著低于其余產地的樣品(p< 0.05)。綜上，陽澄湖和固城湖產地的中華絨螯蟹的膽固醇含量較高，主要體現在蟹黃和蟹膏部位，這可能與生長環境相關。

圖3 中華絨螯蟹不同部位的膽固醇含量

圖4 不同產地中華絨螯蟹的膽固醇含量

3 結論

本研究首先建立了測定中華絨螯蟹中膽固醇含量的超高效液相色譜檢測法，該方法線性優良、準確度和精密度高，可用于快速準確分析不同產地中華絨螯蟹膽固醇含量。結果表明，產自陽澄湖和固城湖中華絨螯蟹的膽固醇含量高于黃河和遼河產地，差異性主要體現在蟹黃和蟹膏部位，肌肉部位膽固醇含量差異性較小。