改進的固相萃取/高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸殘留量

(1.杭州市食品藥品檢驗研究院，杭州 310017；2.島津技邇(上海)商貿有限公司，上海 200052)

草甘膦( Glyphosate，GLY)是一種高效、低毒、廉價的內吸傳導型廣譜滅生性除草劑，廣泛運用于全球各個農業領域[1]。草甘膦在環境和生物體內不斷富集, 通過食品和飲用水進入人體內, 對人體造成危害[2]。隨著全球草甘膦使用量不斷增大，其殘留問題越來越受到關注，歐盟和日本作為我國茶葉出口的兩大重要市場，均對茶葉制定了極為苛刻的農藥殘留限量標準[3，4]。我國食品安全國家標準GB2763—2014《食品中農藥最大殘留限量》規定，茶葉中草甘膦限量為1 mg /kg。研究表明，GLY 及其主要降解產物氨甲基膦酸( Aminomethyl phosphonic acid，AMPA) 具有與有機磷化合物類似的毒理，主要是與膽堿脂酶結合, 能引起神經過度興奮、運動失調, 昏迷, 呼吸中樞麻痹, 癱瘓甚至死[5]。新西蘭等國家對草甘膦的限量要求即包括GLY 和AMPA 的總和。

由于GLY 和AMPA均為強極性兩性化合物，因其難揮發而在應用于氣相色譜(GC)和氣質聯用(GC-MS)檢測時，因氣化需要引入許多物質，操作相對繁瑣，而由于其紫外光區無吸收的特點，無法用帶紫外檢測器或者二極管陣列檢測器的液相色譜進行檢測[6-8]。而目前普遍采用的檢測方法是GLY和AMPA經凈化處理后，在硼酸鹽緩沖溶液中經9-芴甲基氯甲酸酯( FMOC-Cl)衍生化，形成在液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)上響應較好的衍生產物GLY-FMOC和AMPA-FMOC[9，10]。

現有行標檢測方法前處理，特別是凈化過程繁瑣復雜，耗費較多試劑，基質干擾大，耗時費力。目前常用的液-液分配萃取-離子交換柱凈化技術試劑用量大、操作步驟多，尤其在洗脫過程中選擇不合適的離子交換柱會造成回收率偏低，給樣品準確定量造成很大的困難[11-13]。本文對GLY 和AMPA的色譜和質譜條件進行了優化，并對前處理提取凈化方式進行了改進，過程簡單，方法快速，回收率和重現性較好。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津公司高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀，配Shimadzu LC-30A高效液相色譜儀;Shimadzu LCMS-8050串聯四級桿質譜儀;Mili-Q去離子水發生器(美國Millipore公司);MS3旋渦混合器。

草甘膦(GLY)、氨甲基膦酸(AMPA)(純度≥99 %，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)；氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl，純度≥98%，百靈威公司)；乙腈(色譜純，美國Merck公司)；乙酸銨、硼酸鈉、二氯甲烷(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；WondaSep Glyphosate固相萃取柱(500 mg，6 mL，島津技邇公司)。

1.2 色譜和質譜條件

色譜柱：InertSustainBio C18(3μm，2.1 mm×150 mm)；流動相：A相為5 mmol/L 乙酸銨溶液(含0.1 %甲酸)，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0～6 min，92%～65% A；6～7 min，65%～5% A；7～9 min，5% A；9～9.01 min，5%～92% A；9.01～14 min，92% A。柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min，進樣量5 μL；運行時間：14 min。

離子源：電噴霧離子源(ESI)，負離子檢測方式(ESI-)；多反應檢測(MRM模式)；接口溫度：300 ℃；離子源電壓：3.5 kV；加熱模塊溫度：400 ℃；DL溫度：250 ℃；干燥氣流速：10 L/min；加熱器流速：10 L/min；校準方法：質量軸自動調諧校正；其他質譜分析參數詳見表1。

表1 GLY和AMPA的質譜分析參數

注：*為定量離子對

1.3 標準溶液的制備

分別精密取GLY和AMPA標準品各約10 mg，分別用超純水溶解轉移至10 mL容量瓶中，用水定容至10 mL，作為對照品儲備溶液(濃度約為1000 mg/L)。分別精密吸取兩種對照品儲備溶液適當體積于10 mL容量瓶中，用水稀釋定容，配置成1.0、5.0、10、20、50、100 、250 μg/L的標準品系列溶液。

1.4 供試品溶液的制備

提取：準確稱取試樣約1 g，于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水，旋渦混勻1 min，靜置浸泡1 h，加3 mL二氯甲烷，旋渦混勻1 min，以8000 rpm下離心2 min，取3 mL上清液于15 mL離心管中，加0.9 mL乙腈，混勻，待凈化。

凈化與衍生：將上述待凈化的提取液上樣于已活化好的WondaSep Glyphosate固相萃取柱(依次用5 mL甲醇和5 mL水活化柱子)，取凈化好的流出液780 μL，加200 μL 5 %硼酸溶液和200 μL 1.0 mg/mL(乙腈)FMOC-CL溶液，混勻，室溫衍生過夜后，用0.22 μm微孔濾膜過濾。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

精密取濃度為1.0 mg/L的GLY和AMPA標準溶液780 μL，加200 μL 5 %硼酸溶液和200 μL 1.0 mg/mL(乙腈)FMOC-CL溶液，混勻，室溫衍生過夜，將衍生好的兩種標準溶液分別注入進樣器，隨流動相直接進入質譜儀進行母離子和子離子掃描。實驗發現，GLY-FMOC和AMPA-FMOC在負離子模式下的方法的穩定性和重復性較正離子模式好，故本方法采用負離子模式進行檢測。

在負離子模式下對GLY-FMOC和AMPA-FMOC進行母離子掃描，掃描范圍為m/z350～450，得到 [M-H]-峰，分別為m/z391.9和m/z333.9。確定GLY-FMOC和AMPA-FMOC母離子之后，調節離子源電壓，最終當離子源電壓為3.5 kV時一級掃描相應最高。確定母離子及其條件后，繼續進行子離子掃描，以得到最佳的二級質譜條件，經儀器自帶的二級質譜參數自動優化程序，得到GLY-FMOC和AMPA-FMOC的二級質譜優化參數(詳見表1)。最終將優化后得到的定量定性離子對、碰撞能力以及Q1和Q3預四級偏置電壓作為GLY-FMOC和AMPA-FMOC的MRM掃描參數。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

本方法先后使用Themo Hypercarb(100*2.1 mm，3 μm)、InertSustain AQ-C18(100*2.1 mm，1.9 μm)、InertSustainBio C18(100*2.1 mm，3 μm)等3種色譜柱進行分離比較。采用Themo Hypercarb、InertSustain AQ-C18色譜柱，GLY峰型拖尾嚴重，而采用InertSustainBio C18色譜柱草甘膦峰型對稱、尖銳。分析原因是：GLY含有磷酸基團，該基團會和色譜柱不銹鋼柱管上殘存的金屬離子結合形成螯合物，導致峰型拖尾，而InertSustainBio C18色譜柱在技術上進行改進，在不銹管柱管和填料之間添加一層Peek內襯，隔絕了不銹鋼柱管上殘存金屬離子與目標化合物的接觸，從而峰型尖銳、對稱，適合GLY及其代謝物的分析，具體MRM譜圖見圖1。

圖1 草甘膦及代謝物MRM譜圖

2.2.2 流動相的選擇

實驗考察了以下3組流動相在上述流動相梯度條件下的色譜行為：(1)A為乙腈，B為水溶液；(2)A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨溶液；(3)A為乙腈，B為含0.1 %(v/v)甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液。結果顯示：流動相水中加入一定量的乙酸銨有助于離子化，流動相2下的目標化合物靈敏度明顯比流動相1高，但流動相1和2的目標峰有明顯的拖尾現象(詳見圖2)，所以本實驗在流動相3的基礎上加入0.1 %的甲酸，既提高了離子化程度，也改善了色譜峰拖尾現象。所以最終將流動相3作為檢測GLY和AMPA的最佳選擇。

圖2 流動相1和2的草甘膦及其代謝產物的MRM結果

2.3 提取和凈化方式的優化

由于GLY和AMPA有很強的極性，極易溶于水，一般采用純水、硼酸鹽緩沖液或者NaOH溶液等進行提取。本實驗用上述3種提取劑進行回收率考察，結果發現純水的提取效率最高，且樣品經硼酸鹽緩沖液和NaOH溶液提取后，提取液不容易過固相萃取柱，容易引起堵塞。由于GLY和AMPA不溶于有機溶劑，本實驗在純水的基礎上加入二氯甲烷，可凈化水取液中的脂溶性成分，所以本實驗采用水-二氯甲烷體系來提取GLY和AMPA，結果表明兩種目標物回收率較好，滿足實驗要求。

又由于GLY和AMPA含有磷酸基團(以及羧酸基團)和氨基堿性基團，且極性較大，因此本實驗中采用陰離子交換小柱WondaSep MAX、陽離子交換小柱WondaSep MCX、反相模式固相萃取小柱InertSep HLB、對磷酸基團有特定吸附的MonoSpin PBA小柱以及草甘膦專用固相萃取小柱WondaSep Glyphosate，并根據各小柱的特點及適用條件，對茶葉中草甘膦及其代謝物進行凈化，采用WondaSep Glyphosate小柱凈化，回收率最高，WondaSep MAX小柱次之，MonoSpin PBA小柱最低，具體見圖3。最終選擇草甘膦專用固相萃取小柱WondaSep Glyphosate對茶葉進行凈化。

圖3 不同固相萃取柱凈化的效果比較

2.4 線性關系、定量限以及重復性

取1.3中已配置的標準品系列溶液，分別進樣5 μL，以定量監測離子對的離子流中譜峰峰面積(Y)為縱坐標，標準品濃度(X，μg/L)為橫坐標進行線性關系考察，結果見表2。GLY和AMPA在各自線性范圍內線性關系較好(r2均大于0.9992)。

取空白樣品1 g，加入適當稀釋的混合標準品溶液，按法制備供試品溶液，得信噪比為3和10時分別為GLY和AMPA的檢測限(limits of detection，LOD)與定量限(limits of quantification，LOQ)，結果見表2。

取空白樣品1 g，加入適當稀釋的混合標準品溶液，使樣品中GLY和AMPA最終濃度為50 mg/kg，按樣品制備方法重復制備6份，測定GLY和AMPA的含量，重現性RSD在0.8 %～1.2 %，重現性較好，結果見表2。

表2 GLY和AMPA的的線性關系、檢測限、定量限和重復性

2.5 方法回收率與精密度

取空白樣品，每份稱取樣品1 g，分別加入適量的混合對照品溶液，使供試品溶液最終加樣濃度分別為低、中、高3種(分別約為20、50、100 mg/kg)，平行3份，按樣品制備方法制備供試品溶液，檢測含量，計算回收率，結果見表3。GLY和AMPA的3個濃度水平的平均回收率為79.4 %～95.2 %，相對偏差為4.6 %～8.9 %。

以一定濃度的混合對照品溶液(約為50 μg/L)一日內5次重復進樣峰面積的RSD作為日內精密度，以上述的混合對照品溶液3天重復進樣(每天重復進樣3次)峰面積的RSD作為日間精密度，考察方法的穩定性。結果見表3。GLY和AMPA的日內精密度為2.7 %～3.3 %，日間精密度為1.5 %～2.2 %。

表3 回收率與日內以及日間精密度

2.6 實際樣品檢測

利用本實驗建立的優化后的前處理和色譜質譜條件完成了杭州市市場監管局2017年第二季度開展的茶葉監督檢查計劃，對杭州市市售的60批次茶葉中的GLY和AMAP進行檢測。結果顯示，GLY和AMAP均未檢出。

3 結語

本研究建立了一種改進的測定茶葉中GLY和AMAP的固相萃取/HPLC-MS/MS法。樣品經水-二氯甲烷體系提取后，經WondaSep Glyphosate固相萃取柱凈化，用InertSustainBio C18色譜柱分析，以流動相為乙腈和5 mmol/L 乙酸銨溶液(含0.1 %甲酸)梯度洗脫分離。本方法前處理簡單，分離效果好，干擾少，回收率高，重現性好，可作為茶葉中草甘膦及代謝物的分析確證方法。