2型糖尿病應用蛋白質組學技術的研究進展

趙艷雪，閆朝麗

（內蒙古醫科大學附屬醫院內分泌科，內蒙古 呼和浩特 010059）

蛋白質組學（proteome）現已得到大家廣泛認可并應用在動物血清、細胞及組織中，可鑒定出大量蛋白質。該技術主要通過雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）及質譜法（mass spectrometry,MS）的方法可發現大量差異蛋白具有共同的生理病理作用，可作為相關聯的一組蛋白群整體研究[1]。目前對糖尿病背后的基因、蛋白變化等具體發病機制仍未明確，自從有研究者[2]通過該技術定量并鑒定到糖尿病患者及對照組的組織、細胞或細胞器中存在差異蛋白的表達，蛋白質組學技術就越來越受到廣泛關注。

1 蛋白質組學發展過程

蛋白質組學的研究對象是蛋白質組，蛋白質組的概念首次由wlkins和williamstochu提出，當時定義為由一個基因組編碼的全部蛋白質[3]。隨后有學者對此定義進行了完善，即在細胞中由基因組表達的及表達后修飾的所有相關蛋白質。隨著科學不斷發展，目前認為蛋白質組是一個包含生物體所能表達全部蛋白質的領域，且存在時間和空間上動態變化。簡而言之，蛋白質組學就是通過整體、動態、定量的方法對蛋白質組成的研究，并由此進一步獲得對疾病發生、發展等機制的具體過程。

目前血清蛋白質組學方面的研究得到普遍應用，首先在血清中尋找出差異蛋白質位點，然后從差異蛋白中鑒定與疾病相關的血清蛋白質，通過生物信息學處理后研究差異蛋白的結構和功能。從蛋白質組學的角度來看，2型糖尿病是一種多種病理生理機制共同作用的疾病，會有多種異常蛋白的表達。因此通過蛋白質組學的方法分析2型糖尿病組織和血清的蛋白質表達譜變化，為2型糖尿病的發病機制、早期診斷的相關特異性標志物和藥物靶點治療等方面開辟新方法[4,5]。

2 蛋白質組學的主要方法學

2.1 雙向凝膠電泳（two dimensional electrophoresis,2-DE） 2-DE的技術路線最早由Smithies等[6]提出，后來O’Farrell等學者[7]對此做了進一步的優化，使雙向凝膠電泳分辨率得到了提高。雙向電泳的原理主要是以膠條和SDS聚丙烯酰胺凝膠為介質根據蛋白質PH和蛋白質分子量大小不同進行電泳分離，分為稱為等電聚焦分離（IEF）和SDS聚丙烯酰胺凝膠，兩者分離方法后后會在SDS聚丙烯酰胺凝膠上留下位點，從而把復雜的蛋白混合物根據PH和分子量不同在二維平面上分布，最后用硝酸銀或考馬斯亮藍進行染色，得到蛋白質表達譜。

2.2 質譜技術（biological mass spectrometry,BMS） 質譜技術基本原理是通過質譜分析儀以離子源、質量分析器和離子檢測器為核心檢測出離子的質量與電荷比大小來分析鑒定未知的蛋白質。傳統的質譜技術僅可用于分析小分子物質，但隨著離子技術經過不斷升級改良，對于生物大分子物質特別是蛋白質類的分析也成為現實。目前改良的技術主要為基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI time-of-flight mass spectrometry,MALDITOF-MS）技術、表面增強激光解析電離（SELDI time-offlight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）技術以及液相色譜串聯質譜法（liquid chromatography-tandemmasss pectrometry,LC-MS-MS）等技術。這些技術的改良成為蛋白質組學的支撐技術，最主要的是應用更為廣泛、方便、精確且重復率得以保證[8]。（1）基質輔助激光解析/電離飛行時問質譜（MALDI time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）：MALDI-TOF-MS技術原理是將微量蛋白質與過量的小分子的混合液體點到樣品靶上后先將樣品離子化，然后再使用基質與激光直接照射離子化樣品與之結合成結晶薄膜，最后用高電壓使待測的樣品經過電離過程后得到肽質量指紋譜（PMF）的方法。最終質譜分析所得肽質量指紋譜與多肽蛋白數據庫中蛋白質的理論肽段進行比較，從而對所測蛋白質進行鑒定。它具有準確性好、靈敏度高、重復性及高通量性等特點[9]，在2型糖尿病發病機制方面有很多重要研究成果應用涉及該技術，如有國內學者[10]應用MALDI-TOF-MS法檢測視黃醇結合蛋白4基因多態性與2型糖尿病的相關性發現RBP4基因多態性位rS17484721AA基因型攜帶者增加胰島素抵抗的風險。（2）表面增強激光解析電離（SELDI-TOF-MS）：SELDI-TOFMS技術是一種軟電離生物質譜，其原理為設置好離子裝置中的飛行時間后，使用脈沖氮激光能量直接照射在固相吸附蛋白質芯片的表面，將獲取的樣品蛋白從芯片表面中電離出來，最后根據樣品蛋白電離飛行時間測量計算出樣品蛋白的電荷和質量。利用這種技術可對待測樣品進行直接檢測，具有高靈敏度、技術難度低、高通量性等特點，相關研究更證明此技術適用于臨床篩選新的疾病標志物、早期診斷和預后評估提供了可能[11,12]。黃波等[13]利用此項技術結和生物信息學建立了敏感性和特異性均較高的T2DM腎病診斷模型，為糖尿病腎病的診斷作出了貢獻。（3）液相色譜串聯質譜法（liquid chromatography-tandem masss pectrometry,LC-MS-MS）：該技術是一種具有高靈敏度、高準確度以及分離范圍廣的快速分離方法，且能將的對未知化合物的結構破環性小，對應的標準樣品要求比較低。液相的色譜和質譜聯用技術的結合可將離子化水平發揮更為極致，能夠使通過色譜純化后的離子在電場和磁場的綜合作用下，按照質量數和電荷數的比值大小依次成譜被記錄下來。從而可直接獲得待測樣品蛋白的相關結構信息。然后利用混合編程掃描，進一步獲的待測蛋白的相關信息。有學者用LC-MS-MS技術研究2型糖尿病患者血清氨基酸水平與胰島素抵抗時與臨床資料結合分析后得出血清氨基酸水平在糖尿病患者中具有顯著的差異，且相關氨基酸表達水平與糖脂代謝狀況密切相關[14]。

2.3 生物信息學（biological information） 生物信息學的主要內容是對蛋白質組學數據庫檢索，數據庫通過連接數學、計算機以及統計學等學科衍生而來各種方法獲得生物大分子相關的信息[15]。具體包括為進行蛋白注釋、差異表達蛋白的功能分類、亞細胞結構定位及功能富集聚類分析等內容。簡單來說，蛋白質組學的生物信息學就是將質譜后得到的譜圖數據進行分析處理后將網上現有的生物基因蛋白數據庫進行比對分析，即可得到待測樣品差異蛋白的相關信息。

3 蛋白質組學在2型糖尿病中的研究進展

2型糖尿病是一種在遺傳、環境等因素刺激下導致高糖毒性、胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂等多種危害機體慢性代謝性疾病。目前已成為人類健康殺手最主要的慢性疾病之一。但是糖尿病患病人數仍在全球范圍持續增長，據統計，2017年全球糖尿病的患病人數已高達4.25億，預計2015年將達到6.29億[16]。目前蛋白質組學技術在新發2型糖尿病領域主要研究內容為：①新發2型糖尿病標記物的篩選鑒定及早期篩查；②探索2型糖尿病發病機制及與環境的發生發展關系；③尋找新的治療靶點、療效評估及預后判斷等研究，現就蛋白質組學在新發2型糖尿病研究中的基礎及臨床做一敘述。

3.1 蛋白質組學在2型糖尿病發病機制的研究 有學者[17]運用蛋白質組學方法揭示了2型糖尿病發病的可能機制，具體為機體接受多種發病信號后蛋白質的二級結構域和翻譯后修飾發生多態性改變引起。Ahmed團隊[18]于2005年首次描繪出了人胰島素的蛋白質圖譜，為糖尿病是胰島功能方面的研究提供了便利，圖譜共有700多個蛋白被檢測到，且具有很高的重復性。同時還發現與糖尿病的疾病發展有關的差異蛋白表達如熱休克蛋白、膜聯蛋白等差異蛋白。Rutter等學者[19]通過蛋白質組學對健康和疾病中胰島素的差異的研究中發現在mRNA和蛋白水平中某些關鍵因子表達變化可能是導致胰島功能分泌缺陷的原因。研究表明胰腺癌也許會導致糖尿病的發生。Basso等[20]在胰腺癌相關糖尿病的蛋白質組學研究中發現了胰腺癌相關糖尿病的致病因子S-100鈣結合蛋白，并且此蛋白與腫瘤相關的蛋白具有同源性。

3.2 蛋白質組學與2型糖尿病并發癥的研究 目前關于蛋白質組學在2糖尿病并發癥領域研究多為糖尿病腎病和視網膜病變的研究。研究已發現糖尿病腎病的發病機制及早期標記物取得一些成就，在一項用尿蛋白組學預測糖尿病腎病的實驗中通過比較正常人和高發人群的尿蛋白檢測出700多個尿蛋白峰后得出蛋白峰中存在很好的預見性，即可以較好的預見糖尿病腎病的發生趨勢，為糖尿病腎病患者早期診斷提供線索，優于尿微量白蛋白2型對糖尿病早期腎病的診斷[21]。

糖尿病視網膜病變是糖尿病微血管病變最常見的并發癥，是目前中老年人導致失明的主要原因。它的發病機制不僅只與體內糖脂代謝相關，原因是許多血糖控制較好的患者仍可發生，且視網膜病變的病理變化與免疫、炎癥等反應密切相關。有學者在雙向電泳在視網膜蛋白研究中，通過對比正常大鼠和糖尿病SD大鼠的視網膜組織差異蛋白表達情況得出兩者之間的確存在差異，觀察到糖尿病大鼠視網膜組織蛋白發生了改變，為差異蛋白的鑒定和功能分析提供重要基礎[22]。Takahashi等[23]應用iTRAQ技術在研究小鼠2型糖尿病的相關血清蛋白中發現視網膜微血管內皮細胞滲透性的改變可能與人類的同系物SERPINA3有關，這可能是糖尿病視網膜病變的發病機制。所以，上述這些差異蛋白的檢出及鑒定，可以為糖尿病視網膜病變的發病機制的了解提供了很好的線索。

蛋白質組學技術作為研究2型糖尿病及其并發癥一種重要橋梁，它不僅提高了人們對此疾病從宏觀表型到微觀蛋白質組更為深刻的認識作用，還提供了新的方式使我們更加了解該病的發病機制是多種因素共同作用的結果，且遺傳、環境、免疫因素相互作用，十分復雜。但可以通過鑒定疾病相關的的分子標志物，為早期診斷、尋找新的藥物靶點等方面提供新的途徑[24]。

4 蛋白質組學研究存在的問題以及展望

雖然蛋白質組學的方法研究對2型糖尿病分子水平上的研究具有推動作用，但該技術仍存一些技術局限性、血清蛋白未能有效提取、重復性不理想、研究耗時長、費用昂貴等諸多問題需要完善和解決。

首先排除高豐度蛋白質對低豐度蛋白質的掩飾是血清樣品預處理的關鍵所在。血清標本的特殊性會對結果產生干擾，主要原因為血清中與疾病發生發展的關鍵的低豐度的蛋白可被存在的80%左右的高豐度蛋白質（包括白蛋白、IgG等）產生干擾，妨礙有效差異蛋白的檢出。除此之外，雙向電泳中的凝膠由于自身存在局限性，所以很難將血清中濃度范圍較大蛋白全面地展示出來。其次該研究技術中的分離技術和圖譜鑒定的對于具有極酸性、極低拷貝的蛋白上的應用存在困難。此外，建立一個可反映系統性變化中的蛋白質系統很難實現，主要是由于蛋白組學技術本身重復性有限難以統一動態變化的蛋白差異結果所致。最后，在探索2型糖尿病發病機制及與環境的發生發展關系過程中，蛋白質組學技術存在即使有相同的研究目的，但不同的研究人員結論也有可能偏差的問題，主要與待測樣品及研究技術不統一相關，如樣本獲取途徑、保存方式以及蛋白質芯片不同，所以解決這些問題的關鍵就是要對研究技術進行進一步的提高[25]。