紅棗多糖提取、分離與純化研究進展

楊燕敏，高琳，張仁堂，張東旭，鄭振佳

（山東農業大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東泰安271018）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.），又名中華大棗，是鼠李科棗屬植物棗樹的果實[1]。棗樹在我國已有四千多年的栽培歷史，主要分布在西北地區、黃河流域地區和東部地區[2]。我國主要的品種有冬棗、金絲小棗、和田玉棗、壺瓶棗、長棗和灰棗等。紅棗營養豐富，具補虛益氣、養血安神與健脾和胃等多種保健功能[3]，有“日食三顆棗，終身不顯老”之說。多糖是紅棗中一種重要的生物活性物質，研究表明紅棗多糖具有抗氧化、降血脂和保肝等多種生物活性[4]，逐漸受到人們的關注。因此紅棗多糖相關的產品加工具有廣闊的發展前景。

多糖，又稱多聚糖，是由醛糖或酮糖通過苷鍵鏈接在一起的天然高分子化合物[5]。目前提取多糖的主要方法有：水提法、超聲輔助浸提法、微波輔助浸提法、酶提法和堿液提取法等[6]。對近年來大棗多糖的提取、除雜質和分離純化方法的研究現狀進行了綜述，為植物多糖的相關研究及開發利用提供參考。

1 紅棗多糖的提取

1.1 熱水提取

熱水提取法是常用的方法，提取溶劑主要有水和堿液，該方法具有簡單、方便、成本低等優點，缺點為時間長、效率低以及多糖易降解[7]。采用堿液輔助熱水提取多糖可以提高粘多糖以及酸性多糖的溶解度，提高提取率。陳國梁等[8]用熱水浸提法研究浸提溫度、料液比、提取時間3 因素對冬棗多糖提取的影響，確定了最佳工藝參數：溫度為 90 ℃、料液比為 1∶15（g/mL）時提取率最佳，而提取時間對多糖得率無明顯影響。潘瑩等[9]用熱水浸提法在 100 ℃按料液比 1∶25（g/mL）提取4 h 提取粗多糖。李杰等[10]采用熱水提取法提取敦煌圓棗中的多糖，通過試驗分析影響熱水提取法提取紅棗多糖提取率的因素順序為：時間＞溫度＞料液比，確定了較優工藝參數為：提取時間3.5 h，提取溫度95 ℃，料液比 1∶12（g/mL）浸提 2 次，多糖提取率可達 2.53%。楊云等[11]采用正交研究堿液提取大棗多糖，其各因素對多糖提取率的影響大小為：提取溫度＞提取時間＞溶劑體積＞堿的種類，最佳提取工藝為：將 20∶1（mL/g）的0.5 mol/L Na2CO3溶液與棗渣體積置于80 ℃浸提3 h。

1.2 超聲輔助提取

超聲輔助提取法是通過頻率在20 kHz 以上的超聲波對媒質產生機械振動和空化作用破碎細胞提高多糖的提取率[12]。李福帥等[13]在單因素試驗基礎上，利用響應面分析法對超聲輔助提取長紅棗多糖試驗進行優化，試驗得出影響紅棗多糖提取率的因素順序為：超聲溫度＞超聲時間＞料液比，最佳提取工藝參數為：料液比 1∶16（g/mL），超聲溫度 50 ℃，超聲時間30 min，提取所得長紅棗多糖得率為15.12%。Li 等[14]采用方法學優化超聲提取條件，結果表明：最佳提取條件是溫度45 ℃～53 ℃、聲波功率為31.7 W、時間為20 min、水固比 20∶1（mL/g）。黎云龍等[15]用超聲輔助熱水提取駿棗多糖，用響應面法設計優化了工藝參數，試驗所得最優工藝參數為：水提取溫度83 ℃、提取時間4 h、液固比 17∶1（mL/g），駿棗粗多糖得率為9.51%。和熱水提取法相比不僅縮短了提取時間并且在多糖得率方面也有所提高。超聲輔助提取紅棗多糖與熱水浸提法相比有著提高多糖提取率，縮短提取時間，提取方法簡便易行的優點[16-17]。

1.3 微波輔助提取

微波是頻率介于300 MHz 和300 GHz 之間的電磁波，作用于植物細胞壁，其熱效應促使細胞膜酶失去活性和細胞壁破裂以提取多糖的方法[12]。白艷林等[18]用微波輔助提取法提取山西紅棗中的多糖，在單因素基礎上設計響應面分析法優化試驗，結果表明最優工藝參數為：提取時間 5.5 min，液料比 37∶1（mL/g），微波功率830 W，提取次數為3，多糖的提取率為6.78%。李新明等[19]用響應面優化微波輔助提取紅棗多糖的參數為：微波功率 800 W，液料比 8∶1（mL/g），提取時間75 min，提取次數為3；在此條件下多糖提取量為27.28%。Rostami 等[20]研究了微波輔助浸提法提取大棗多糖，得到在微波功率400 W、提取溫度75 ℃、提取時間 60 min 時，以液料比 30∶1（mL/g）為最佳條件，可獲得多糖最大提取率。

1.4 酶法輔助提取

酶提取法常用的酶有果膠酶、蛋白酶、纖維素酶等，酶類可以分解細胞壁結構，加速多糖釋放和提取[12]。吳洪斌等[21]利用纖維素酶對新疆紅棗進行多糖提取，運用響應面優化工藝參數，提高多糖提取率，試驗所得最佳提取條件為：酶添加量0.85 mg/mL、酶解時間 60 min、酶解溫度 50.0 ℃、液料比 10∶1（mL/g），其多糖提取含量達7.71%。石勇等[22]以紅棗為材料比較熱水提取法和酶提取法，熱水提取紅棗多糖時間為6 h，多糖得率為2.69 %；利用同等單位復合的果膠酶、纖維素酶、蛋白酶對紅棗中的蛋白質、纖維素等進行酶解處理，獲得提取紅棗多糖的最佳條件為：提取溫度48 ℃、提取時間2.2 h、復合酶添加量1.0%，多糖提取率為4.61 %，復合酶法提取效果優于熱水提取法的結論。

2 多糖的分離純化

2.1 蛋白的去除

蛋白質約占紅棗中干重的3.3%[23]，與多糖同為親水性大分子物質，在多糖提取過程中會大量存在。去除蛋白質的方法有Sevage 法，三氯乙酸法和酶解法等。Sevage 法利用蛋白質在氯仿等有機溶劑中變性而不溶于水的特性離心除去蛋白質，此法對多糖的性質影響較小但提取效率比較低。三氯乙酸法的原理是蛋白質中的疏水基團可以與三氯乙酸反應使蛋白質變性而相互凝聚沉淀，離心去除[24]，此法操作簡單但酸性強，可能引起多糖的降解。酶解法是采用蛋白酶可以分解蛋白質達到去除蛋白質的效果，具有反應條件溫和，提取效率高的特點。楊斌等[25]以蛋白清除率和多糖保留率為指標比較了Sevage 法、三氯乙酸法、酶解法對多糖除蛋白效果，結果表明：酶法蛋白清除率（56.57%）＞Sevage 法（47.47%）＞三氯乙酸法（45.13 %），其多糖保留率（98.16%）＞Sevage 法（67.65%）＞三氯乙酸法（61.05%）。孔繁東等[26]以蛋白質清除率和多糖保留率為指標，研究Sevage 法、酶法、酶法-Sevage 法聯用、三氯乙酸法4 種方法對多糖除蛋白的比較。結果表明：酶-Sevage 結合法蛋白清除率（90.4334 %）＞酶法（80.7644%）＞Sevage 法（65.64%）＞三氯乙酸法；三氯乙酸法多糖保留率（96.1002%）＞酶法（95.2901%）＞酶-Sevage 結合法（91.9932%）＞Sevage 法（65.64%）。

2.2 脫色

色素也是多糖提取中的主要雜質，脫色的常用方法有活性炭脫色法、雙氧水法、樹脂脫色法等。活性炭是靠范德華力對色素顆粒的吸附作用使其與目標物質分離而達到脫色目的[27]。雙氧水在水溶液中可電離出過氧氫根離子攻擊色素，利用H2O2的氧化性使有色物質脫去原有色素[28]。樹脂是一種吸附性質的脫色劑，具有穩定性高，吸附速度快等特點。潘瑩等[9]用活性炭脫色和樹脂（LS-850、AB-8 和 D-101）脫色 2 種脫色方法對冬棗多糖進行脫色，結果表明：活性炭法脫色率（78.71%）＞D-101（46.08%）＞LS-850（20.77%）＞AB-8（14.75%），活性炭法多糖保留率（90.22%）＞AB-8（90.12%）＞D-101（83.00%）＞LS-850（80.05%），活性炭脫色效果明顯高于樹脂（LS-850、AB-8 和D-101）脫色。蔣俊等[29]先后比較了大孔樹脂（D315 和D303）脫色、雙氧水脫色和活性碳脫色3 種脫色對多糖的脫色效果的影響，結果表明，大孔樹脂D303 脫色率（86.2%）＞D315（59.4%）＞雙氧水（48.7%）＞活性炭（22.1%）；活性炭多糖保留率（89.1%）＞D315（84.4%）＞D303（75.5%）＞雙氧水（72.2%），大孔樹脂（D315 和D303）脫色法明顯優于雙氧水脫色和活性炭脫色。

2.3 柱色譜分離

柱色譜分離方法主要有：凝膠柱層析法、離子交換層析法和大孔樹脂柱層析等。凝膠柱層析的分離原理是按物質的大小進行分離[24]；離子交換層析是通過帶電的溶質分子與離子發生交換，使離子交換層析介質達到分離和純化的方法[30]，大孔樹脂層析是通過物理吸附可選擇地吸附分離提純物質。陳晉芳[30]先進行DE-52 離子交換柱層析，通過不同濃度的離子洗脫后，得到不同的大棗多糖組分；再進行采用Sephadex G-100 柱層析，進一步得到分子量大小不同的大棗多糖組分：JP1、JP3、JP3a 和 JP3b。李小平[31]采用 DEAE-纖維素離子交換柱層析法對棗多糖進行了組分分析，得到了5 種多糖組分。陳晴晴等[32]選出DM-18 型大孔樹脂為分離沙棗多糖的分離材料，在最佳分離條件下，DM-18 型大孔樹脂對沙棗多糖的吸附率達90.23%，解吸率達92.37%，得出純化多糖的純度為70.56%。Zou 等[33]用DEAE-52 纖維素陰離子交換柱和Sephadex G-200 柱層析法分離純化了灰棗中的HP1 和HP2 兩種酸性多糖。

3 多糖含量的測定

多糖含量測定傳統的方法有苯酚-硫酸法和蒽酮比色法，文獻最早可追溯至1983年[34-35]。苯酚硫酸法[36]是利用在硫酸的作用下多糖先水解成單糖，脫水生成糖醛衍生物后與苯酚生成橙黃色化合物，進行比色法測定。蒽酮比色法[37]原理是糖遇濃硫酸會脫水生成糠醛及其衍生物，該衍生物可與蒽酮發生反應生成藍綠色的絡合物，在620 nm 處有最大吸收，顏色的深淺與糖含量有關。王文潔等[38]比較蒽酮比色法與苯酚-硫酸法測定多糖含量的差異，蒽酮比色法測得多糖含量為27.79%，穩定性相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.11%，精密度和重現性RSD 為1.00%；苯酚硫酸法測得多糖含量為22.06%，穩定性RSD 為0.22%，精密度和重現性RSD 為1.31%，得出2 種測定方法均穩定可行、操作簡便、準確可靠。

儀器分析方法主要有示差法、蒸發光散射檢測法、柱前衍生化法等，此類檢測方法主要是將多糖水解后進行單糖組成測定。示差折光檢測器根據流通池內的化合物折射率不同的原理而對樣品進行檢測，常與高效液相色譜儀連用檢測糖類[39]，對糖類檢測靈敏度較高。蒸發光散射檢測器是將柱洗脫液霧化形成氣溶膠，在加熱的漂移管中將溶劑蒸發，最后余下的不揮發性溶質顆粒在光散射檢測池中得到檢測的檢測器[40]。衍生化是利用化學反應改變目標化合物分子中的原子或官能團，通過檢測新生產物對目標化合物進行氣相色譜定性和定量分析[41]。申明月等[42]采用AKTA Puri-fier-100 生物分子純化系統對多糖進行純化，高效液相色譜-示差折光檢測法進行了純度檢測，得出純化的最佳條件：上樣量5 mL，超純水洗脫，流速2.6 mL/min，純度大于99%。Li 等[43]用蒸發光散射檢測器和高效液相色譜連用測定了低聚果糖的含量，在West-XBig 酰胺柱上進行梯度洗脫，它們的檢測限（limit of detect，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分別低于 3.63 μg/mL 和 24.82 μg/mL，回收率在99.2%～102.6%之間。郝蕾蕾等[44]以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）作為衍生劑，用高效液相色譜法分析了黃河灘棗多糖的單糖組成及摩爾比為D-半乳糖醛酸（0.27）、L-鼠李糖（0.50）、D-甘露糖（0.54）、L-阿拉伯糖（1.00）、D-葡萄糖（2.03）、D-半乳糖（5.40）。Wang 等[45]采用高效液相色譜-質譜聯用法對PMP 衍生后多糖含量進行測定。

4 存在問題以及發展前景

紅棗多糖具有廣泛的生物活性和廣泛的研究價值。目前研究中主要存在以下問題：一是由于提取過程中的粗多糖與蛋白質、色素等雜質共存，在去除雜質的同時會有部分多糖損失；二是多糖種類繁多、結構復雜，多糖的結構確證難度大；三是對于多糖活性的研究主要集中于粗提物，對于多糖的組成和精準功能評價的研究較少。此外，黑變紅棗是紅棗通過固態發酵精深加工的一種產品，發酵后多糖的變化以及功能性評價研究也亟待開展。因此，尋找建立多糖的高效提取、分離純化和檢測方法仍舊是今后研究的重點。多糖具有生理活性廣泛與低毒性的特點，隨著生活水平的提高和健康的意識增強，在食品、藥品以及保健品領域將會有廣闊的市場前景。