非洲豬瘟研究進展

郗永義，林艷麗，王友亮

軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASF virus，ASFV）感染家豬或野豬引發的一種急性、烈性傳染病，蜱是ASFV的自然宿主和傳播媒介。感染后癥狀一般表現為全身出血、呼吸障礙和神經癥狀等，病程時間短，病死率高，最急性和急性型感染死亡率高達100%。世界動物衛生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，也是我國重點防范的一類動物疫病。ASF發病癥狀與普通豬瘟相似，臨床上很難鑒別診斷，只能依靠實驗室檢測確診，目前還沒有有效疫苗和防治藥物。ASF只對豬高度感染，還未發現ASFV感染人現象。

ASFV是直徑為200 nm的正二十面體雙鏈DNA病毒,DNA核心直徑為70～100 nm，外周是直徑為170～190 nm的衣殼和含類脂的囊膜。該病毒對生存環境非常耐受，在糞便內可存活11 d（室溫），熏肉和腌肉中可存活1～6個月，干肉中可存活10個月，凍肉中可存活3年以上。ASFV主要通過巨胞飲和網格蛋白介導的胞吞方式進入宿主細胞[1]，主要感染豬網狀內皮細胞和單核巨噬細胞，引發細胞凋亡，嚴重影響宿主免疫系統。

1 流行病學及診斷

1921年，東非國家肯尼亞首次確認非洲豬瘟疫情，隨后，ASF在非洲流行。1957年首次傳入歐洲（葡萄牙），1971年傳入美洲（古巴），2007年，首次傳播至歐亞接壤的格魯吉亞，隨后傳入亞美尼亞、阿塞拜疆和俄羅斯，并在高加索地區定殖。2012年傳入烏克蘭，2013年傳入白俄羅斯，2014年傳入拉脫維亞、愛沙尼亞。2017年，非洲豬瘟疫情以地中海和高加索山脈為基地，繼續西進和東擴，向西傳入捷克、羅馬尼亞，向東到達俄羅斯的秋明州、額爾斯克等西伯利亞地區[2-3]。2018年8月，我國遼寧確診首例疫情，之后我國多地檢出非洲豬瘟疫情，截至2019年2月，已有24個省份發生過家豬和野豬非洲豬瘟疫情。

ASFV傳播有多種途徑：一是直接接觸傳播，包括家豬-家豬、家豬-野豬、野豬-野豬之間的直接接觸傳播；二是經環境間接傳播，ASFV對外界環境抵抗力較強，在糞便中可存活11 d，在受污染豬圈內可存活1個月，在腐爛血液中可存活15周，污染環境（豬舍、車輛、衣服、工具等）處理不徹底常是ASF反復暴發的重要原因；三是經軟蜱傳播，軟蜱是ASFV的儲存宿主，軟蜱的交配和產卵也是病毒傳播的途徑，且病毒可在軟蜱組織內存活數年時間。ASFV是一種蜱傳的大型DNA病毒，在豬、野豬和軟蜱之間具有復雜的傳播周期，并編碼150多種且一半功能未知的病毒蛋白。該病毒顯示出高遺傳和抗原多樣性，全球已鑒定出24種基因型和8種血清群。

ASF癥狀復雜，難以和普通豬瘟區別診斷，存活豬也常成為病毒攜帶者，繼續感染其他健康豬。豬感染ASFV后雖可產生特異性抗體，但目前為止還沒有發現這些抗體具有中和作用和保護效果。根據流行病學、臨床癥狀和病理解剖可對ASF做出初步診斷，但確診需要通過病原檢測（包括瓊脂擴散試驗、補體結合反應、免疫熒光技術和血吸附試驗等）、血清學檢測（間接免疫熒光試驗、酶聯免疫吸附試驗、熒光抗體法等）和分子生物學檢測（DNA原位雜交、常規PCR、實時熒光定量PCR等）[4]。

2 致病機理

ASFV主要經呼吸道和消化道進入豬體內，病毒感染機體后，首先在扁桃體中進行增殖，而后伴隨血液和淋巴系統侵入全身，引發病毒血癥，并在血管內皮細胞、巨噬細胞內進行復制，侵襲血管和淋巴管，造成相應器官組織出現漿液性滲出、出血、血栓和壞死等病理變化。病死豬經常表現出全身組織器官出血、免疫系統受損、淋巴細胞減少等癥狀[5]。

ASFV感染的靶細胞主要是豬單核-巨噬細胞，此外也感染樹突狀細胞、內皮細胞、巨核細胞等。病毒入侵細胞須受體-配體介導，但ASFV的受體和配體還不明確，病毒在受體介導下，通過巨細胞飲和網格蛋白介導的胞飲兩種方式進入細胞，并在細胞內進行病毒的復制和包裝等[1]。

3 基因組研究

ASFV基因組為末端共價閉合的單分子線狀雙鏈DNA，長度為170～190 kb，基因組中央區是長約125 kb的保守區，兩端序列長度變化較大（左側約48 kb，右側約22 kb），兩端基因區含有數個多拷貝基因家族。由于兩端基因拷貝數不同，導致不同毒株間的基因長度差異較大。ASFV整個基因組含有150多個開放讀框（ORF），可以編碼150～200種蛋白質[6]。

ASFV編碼的蛋白質眾多，按其功能可分為5類，即執行DNA復制、修復和RNA轉錄功能的蛋白，病毒組裝和結構蛋白，機體免疫調控蛋白，多拷貝基因家族和其他未分類蛋白[7]。

3.1 執行DNA復制、修復和RNA轉錄功能的蛋白

參與DNA復制的ASFV基因有G1211R（編碼DNA聚合酶B）、E301R（編碼PCNA樣蛋白）、C962R（編碼核苷三磷酸酶）、F1055L（參與起始點復制）等[8-9]。ASFV入侵巨噬細胞后，巨噬細胞會激發活性氧反應機制破壞病毒基因組，ASFV可啟動一系列基因表達修復DNA破損[10-11]，如由O174L（編碼DNA聚合酶X）、NP419L（編碼ATP依賴的DNA連接酶）和E296R（編碼脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶）組成的最小DNA修復機制。不同于其他病毒，ASFV的復制、修復和轉錄大多依靠自身基因表達完成[8]，如 由EP1242L、C147L、NP1450L、H359L、D205R和CP80R編碼蛋白組成的病毒RNA聚合酶Ⅱ，G1340L、I243L等編碼的階段性轉錄調控因子，以及參與轉錄本頭尾端修飾的NP868R編碼蛋白等[12]。

3.2 病毒組裝和結構蛋白

參與ASFV組裝的蛋白有20多種[13-15]。pp220多聚體蛋白（CP2475L）酶切后的p150、p37、p34、p14蛋白，pp60（CP530R）酶切后的p35和 p15蛋白，以及SUMO樣蛋白（S273R）共同組成病毒核心殼，核心殼外包裹有源于內質網的單層脂膜形成的正20面體莢膜。ASFV莢膜上含有p72蛋白（B646L）及其伴侶蛋白（B602L）和 p49蛋 白（B438L）。ASFV 內膜上含有 p17（D117L）、p54（E183L）、j18L（E199L）和j5R（H108R）等膜蛋白。E120R編碼蛋白位于細胞內病毒粒子的表面，可將病毒從裝配點傳送至膜表面。

3.3 機體免疫調控蛋白

ASFV之所以引發極高的感染率和致死率，其原因在于表達多種宿主免疫調控蛋白，操控巨噬細胞，對抗先天免疫和獲得性免疫，促進病毒復制、增殖和感染[16-18]。如A238L編碼蛋白可抑制宿主NF-κB等免疫調控基因的轉錄，I329L編碼蛋白可抑制Toll樣受體3信號通路，MGF360和MGF530多拷貝基因可抑制Ⅰ型干擾素反應，DP71L編碼蛋白可阻止PKR或PERK等激酶磷酸化誘導的蛋白合成。此外，ASFV也編碼一些黏附蛋白來促進受感染細胞和病毒顆粒與細胞外環境基質的連接[19]，如CD2v蛋白胞外區序列與人CD2具有較高的同源性，其可以介導紅細胞與受感染細胞或病毒顆粒的結合，同時，CD2v也會抑制機體淋巴細胞增殖。EP153R編碼的蛋白是Ⅱ型跨膜蛋白，含有一個和NK細胞受體相似的結構域（C型凝集素），借助該結構域，EP153R可抑制細胞MHCⅠ類抗原上調和受感染細胞凋亡，促進病毒增殖。

3.4 多拷貝基因家族

ASFV基因組兩端含有一些重復可變區序列以及一些編碼基因，如MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505/530和p22。每個基因都有多個拷貝，基因頭尾方向一致且緊密排列，執行特定的生理學功能[20]。

4 疫苗研究

鑒于ASFV對養豬業和國家經濟及食品安全造成的巨大影響，疫苗研制成為許多科學家的研究主題，研究疫苗包括滅活疫苗、減毒疫苗、基因工程疫苗、亞單位疫苗和核酸疫苗等[21]。但迄今所有針對ASF的疫苗研發生產都告以失敗，主要原因是ASFV有一套完整的抗宿主疫苗應對機制。ASFV基因組可編碼多種蛋白質，用于干擾宿主的天然免疫系統，從而抑制和逃避免疫應答反應，為自身增殖和擴散創造有力條件。

4.1 滅活疫苗

滅活疫苗通過物理或化學手段將病原體滅活，使其失去感染能力，但保留其抗原性。科學家們嘗試通過各種方法研制滅活ASF疫苗，包括經加熱和甲醛等方法滅活的ASFV、用ASFV接種的肺泡巨噬細胞懸浮液制備的滅活疫苗、ASFV感染豬脾組織勻漿并經弗氏佐劑乳化制備的滅活疫苗等，均未能提供有效的免疫保護[22]，即使借助Polygen或Emulsigen-D等免疫增強劑，ASF疫苗仍然沒有產生有效的保護[23]。

4.2 減毒疫苗

減毒疫苗是指致病力減弱但仍具有活力的完整病原疫苗。依據制備工藝，減毒疫苗可分為天然減毒株、傳代減毒株和基因工程重組減毒株3類。和滅活疫苗相比，減毒疫苗能夠誘導強烈持久的免疫應答，但安全性是重點考慮的因素。目前報道的ASF減毒疫苗包括OURT88/3、NH/P68等天然弱毒株和豬骨髓源細胞，Vero細胞和COS-1細胞等傳代致弱毒株，但這些減毒疫苗均沒有產生有效的免疫應答，而一些疫苗在使用時還釀成嚴重的生物安全事故。如1963年，Manso等證實通過豬骨髓細胞傳代的ASF減毒疫苗可抵抗強毒株攻擊，隨后該疫苗在西班牙和葡萄牙進行了田間試驗，卻造成了災難性后果，免疫后的豬均出現肺炎、流產和死亡等免疫副作用，且出現大量病毒攜帶者，后續隨訪觀察證實這些免疫動物即使沒有ASF強毒株攻擊，很多仍會出現慢性感染，死亡率為10%～50%。很多病毒攜帶者雖能長時間保持健康，但大多數最終發展為慢性肺炎或因急性發作而死亡。

基因工程減毒疫苗是指采用分子生物學方法，敲除病毒毒力基因或免疫抑制基因，降低病毒毒力或增加機體對病毒的免疫應答，生產出比傳統減毒疫苗安全且效力更高的減毒活疫苗。已有研究表明，刪除ASFV的某些毒力基因，如TK、B119L[24]、DP71L[25]、MGF360/505[26]，減毒疫苗接種宿主后毒力減弱且呈現出一定的免疫保護效果。ASFV表達多種蛋白用于調控和逃避機體免疫，通過基因工程手段失活病毒的免疫調控基因如A238L[27]、CD2v編碼基因[19]、C 型凝集素編碼基因[28]等，也有助于增強減毒疫苗的免疫反應。

4.3 亞單位疫苗

將含有中和表位的病毒保護性抗原基因通過原核和真核細胞表達，純化收獲的蛋白亞單位疫苗是新一代疫苗發展趨勢。與傳統滅活疫苗和減毒疫苗相比，亞單位疫苗在不降低保護效率的前提下，其安全性也會有較大的提升。p72、p30和p54是ASFV感染后引發機體體液免疫的3個主要抗原，目前ASF亞單位疫苗研究也主要集中在這3種靶標上[29-30]，但研究結果均不理想。如同時免疫含有p30和p54的亞單位疫苗，雖然在豬體內檢測到高滴度的相應抗體，但病毒感染結果顯示該疫苗只能提供50%的生存保護率，且存活宿主體內仍然含有較高的ASFV[31]；另一研究顯示用桿狀病毒表達的p30、p54、p72和p22聯合疫苗雖然能激發機體產生高滴度的中和性抗體，但ASFV感染試驗卻完全沒有顯示出保護效能[32]。

CD2v是另一個ASFV亞單位疫苗研究的熱點靶標，CD2v（EP402R編碼）蛋白位于病毒外膜，是與細胞CD2分子同源的蛋白，具有紅細胞吸附功能。研究顯示CD2v免疫豬可產生抗血紅素吸附抗體和抗單核細胞感染抗體，且對同型毒株產生部分保護作用[19]。此外，將CD2v和EP153R組成的嵌合疫苗也只能提供部分免疫保護[33]，提示除了CD2v等抗原外，還需要其他更多抗原的介入。研制ASF亞單位疫苗，需要對ASFV蛋白有更進一步的了解。

4.4 核酸疫苗

核酸疫苗制備簡單、成本低廉，可同時表達多種抗原且無毒力逆轉的危險，被稱為繼減毒疫苗、亞單位蛋白疫苗之后的第三代疫苗。ASF核酸疫苗大多是將ASFV保護性抗原基因構建成真核表達載體進行制備免疫，不過其免疫療效相比于蛋白疫苗也未獲得明顯提高，仍然不能提供有效保護。如用CD2v、p30和p54等3種蛋白胞外區編碼基因組成的三聯DNA疫苗免疫動物，也只有25%的保護效果[34]。Lacasta等通過表達文庫構建了4029個表達質粒，進行了免疫攻毒保護試驗，其保護率只能達到60%，不過免疫攻毒后存活的豬無排毒現象[35]。

4.5 基于ASFV受體和保護性抗原的疫苗研究

目前介導ASFV入侵細胞的受體和關鍵抗原還不明確。細胞攻毒保護試驗曾發現CD163是ASFV的受體，CD163表達強弱與ASFV感染程度具有正相關性，但利用CRISPR/Cas9敲除CD163基因的轉基因豬并沒有顯示出對ASFV的有效抵抗力，證明CD163不是ASFV的受體[36]。研究表明p12蛋白可能是介導病毒入侵的關鍵抗原，但在ASFV感染細胞實驗中，加入過量p12抗體并沒有有效阻斷病毒結合和感染，提示p12并不是介導病毒吸附的惟一抗原。研究顯示p32、p72和p54在病毒吸附細胞過程中也具有重要作用[32,37]，p72和p54可促進病毒和巨噬細胞的結合，而p32有助于病毒內化。ASFV的受體是哪些，有待進一步深入探討。

5 結語

非洲豬瘟作為一種重要的動物疫病，具有傳染性強、死亡率高、缺少有效的疫苗預防等特征。開展對ASFV的相關研究，尤其是病原學和病毒免疫逃逸研究尤為重要。ASFV具有復雜的基因結構，編碼表達大量病毒復制非必需蛋白，弄清這些蛋白的功能，分析病毒免疫逃逸的機理和致病機制，尋找病毒入侵細胞的關鍵抗原和細胞受體，將為ASF的防控奠定理論基礎，并對疫苗開發和疾病防控提供指導作用。