流感病毒生命周期研究進展

朱艷慧，王升啟,2

1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.軍事醫(yī)學研究院 輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

流行性感冒又稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。流感可分為季節(jié)性流感和大流行性流感。季節(jié)性流感每年都有發(fā)生，而且流感種類非常多，需要對正在傳播的病毒株進行密切監(jiān)視，并針對預測的病毒株每年提供更新的疫苗接種。大流行流感是一種高致病性流感，每隔一段時間就會發(fā)生一次，病毒株會在人群中迅速傳播，導致發(fā)病率和致死率急劇上升，帶來巨大的經濟和社會負擔[1-3]。如1918～1920年H1N1亞型“西班牙流感”、1957～1958年H2N2亞型“亞洲流感”、1968～1969年 H3N2亞型“亞洲流感”、1977～1978年H1N1亞型“香港流感”、2009年首先在墨西哥暴發(fā)的H1N1亞型流感[4]、2013年首先在中國報道的H7N9亞型流感[5]。據世界衛(wèi)生組織報道,每年有290 000～650 000死亡人數與流感引起的呼吸道疾病有關，造成了巨大的疾病負擔[6]。

1 流感病毒生物學簡介

流感病毒是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的分節(jié)狀單鏈負義RNA病毒，病毒顆粒通常為球形，直徑80～120 nm，也有絲狀的長約幾微米[7]。流感病毒可以借助空氣迅速傳播，引起呼吸道感染，導致免疫缺陷的感染者患上嚴重的并發(fā)癥，如肺炎或急性呼吸衰竭等。根據病毒基質蛋白1（matrix 1，M1）和核蛋白（nucleoprotein，NP）的抗原性不同，可將流感病毒分為A（influenza A virus，IAV）、B（influenza B virus，IBV）、C（influenza C virus，ICV）和 D 型（influenza D virus，IDV）。IAV、IBV和ICV可以感染和引起人類呼吸道疾病；IDV主要感染牛，目前還不知道是否可以感染人類。IAV還能夠感染多種動物，如鳥、豬、馬、海洋哺乳動物和其他宿主，引起大流行，根據其表面血凝素（hemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（neuraminidase，NA）的分子特征不同又可分為不同亞型，迄今鑒定了18種HA亞型（H1～H18）和11種NA亞型（N1～N11）[8-9]。IAV的基因組包括8個獨立RNA片段，編碼至少12種功能明確的蛋白。NS片段編碼宿主抗病毒反應拮抗劑NS1（nonstructural protein 1）和核輸出蛋白NS2（也稱為NEP），M片段編碼基質蛋白M1和離子通道蛋白M2，此外還有受體結合蛋白血凝素HA，唾液酸破壞酶神經氨酸酶NA，核蛋白NP，聚合酶蛋白PA、PB1和PB2。PB1片段還編碼N40蛋白和促凋亡蛋白PB1-F2，后者在病毒致病性方面發(fā)揮關鍵作用[10]。3種膜蛋白HA、NA和M2組成IAV的脂質雙層膜，脂膜下是M1基質蛋白。病毒內部的8個單鏈RNA被包裹在病毒核糖核蛋白復合物（viral ribonucleoprotein complexes，vRNP）中，vRNP的蛋白質成分由核蛋白NP和聚合酶蛋白PA、PB1、PB2 組成[11]。

2 流感病毒復制的生命周期

流感病毒復制的生命周期涉及多個步驟：①病毒通過唾液酸受體黏附于細胞表面；②病毒通過受體介導的內吞作用發(fā)生內化；③病毒包膜與核內體膜融合；④病毒基因組vRNA從病毒粒子脫殼并進入細胞質；⑤在核定位信號（nuclear localization signals，NLS）幫助下，vRNA 進入細胞核；⑥互補RNA（complementary RNA，cRNA）的合成和病毒基因組vRNA的復制；⑦以進入細胞核的vRNA為模板合成mRNA；⑧包膜蛋白（HA和NA）的合成和糖基化；⑨其他蛋白的合成；⑩病毒包膜蛋白插入細胞膜子代病毒粒子的組裝和出芽病毒粒子的釋放[12]。

2.1 吸附

流感病毒與呼吸道上皮細胞的唾液酸受體特定結合。不同物種的上皮細胞表達不同的唾液酸受體，甲型流感病毒株識別不同類型的唾液酸受體，這使得人畜共患病傳播困難。人流感病毒株識別人類肺和上呼吸道上皮細胞唾液酸α-2，6半乳糖受體，動物流感病毒株識別鳥類和豬的上皮細胞唾液酸α-2，3半乳糖受體。但人類下呼吸道也可以表達唾液酸α-2，3半乳糖受體，允許高致病禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza，HPAI）感染肺泡巨噬細胞，使得H5N1在人類中廣泛傳播導致原發(fā)性肺炎的發(fā)生。流感病毒HA介導與唾液酸受體的結合。HA是三聚體分子，HA1是宿主細胞受體結合的關鍵位點，而HA2是體內融合的關鍵位點。流感病毒HA蛋白形成膜遠端口袋作為結合位點，其中190螺旋（殘基 190～198）、130環(huán)（殘基 135～138）和 220環(huán)（殘基221～228）形成口袋的三面，保守殘基Tyr98、Trp153、His183和Tyr195位于口袋底部，構成口袋的氨基酸殘基通過氫鍵和范德華力與唾液酸受體相互作用。另外，第二個受體結合位點位于HA1和HA2之間，只有唾液酸α-2，3半乳糖受體具有較弱的結合親和力，唾液酸α-2，6半乳糖受體不能結合到這個位點[13]。

2.2 內吞

流感病毒可通過網格蛋白介導的以及網格蛋白和小窩蛋白非依賴的內吞途徑感染細胞[14]。細胞內吞包括吞噬作用和胞飲作用。吞噬作用通常是指特定細胞消化大顆粒和細菌，如巨噬細胞；胞飲作用是指負責細胞對液體、大分子和病毒等小病原體的吸收。胞飲作用涉及幾個不同的機制：巨胞飲、網格蛋白介導的內吞作用、小窩蛋白介導的內吞作用，以及不依賴網格蛋白和小窩蛋白的通路。網格蛋白介導的內吞作用是依賴受體和結合配體的濃度進入網格蛋白包裹的囊泡（clathrin-coated pits，CCP）發(fā)生的。這些囊泡離開質膜后與其他內吞囊泡或核內體發(fā)生融合。對于網格蛋白介導的內吞作用，涉及2條可能的途徑：①配體和結合受體靶向細胞表面已經存在的CCP，此過程需要G蛋白偶聯受體參與；②結合配體招募網格蛋白和輔助因子形成新的CCP。通過網格蛋白介導途徑進入的流感病毒顆粒，有94%都是在病毒結合位點形成新的CCP發(fā)生內吞作用[15]。

2.3 融合

流感病毒被內吞后，首先經歷第一個酸化步驟早期核內體（pH6），然后被運輸至晚期核內體（pH5），酸化環(huán)境觸發(fā)融合，并將基因組運輸至細胞質中[16]。在流感病毒感染過程發(fā)揮重要作用的核內體是由Rab蛋白和其他因子調控的。在早期核內體中，內化的物質被運輸到不同目的地：回收的配體和受體被返回到細胞表面，而降解的物質被運輸到溶酶體。Rab5參與早期核內體運輸，Rab11或Rab4調控運輸需要返回到細胞表面的配體和受體，Rab7和Rab9調控運輸到溶酶體和晚期核內體[17-18]。流感病毒融合依賴HA的幾個特性，這些特性是在病毒脫殼之前的復制周期中啟動的。在流感病毒粒子中，HA分子具有高度的α螺旋二級結構，處于亞穩(wěn)態(tài)，疏水融合肽隱藏在分子底部。病毒粒子進入核內體后，其低pH環(huán)境觸發(fā)病毒包膜與核內體膜的融合，并啟動融合事件：HA前體多肽（HA precursor polypeptide，HA0）構象變化和M2離子通道打開。由于pH誘導HA0構象改變，將埋藏的HA2融合肽擠壓到HA分子的遠端。新形成的HA2 N端融合肽進入HA三聚體分子內部，與離子化的殘基連接，形成具有融合能力的中性pH結構。融合肽插入核內體膜導致兩膜合并。當插入的HA2的兩端靠近時，兩膜發(fā)生融合，形成明顯的半融合中間體，然后形成融合孔。病毒核的酸化有助于vRNP從核內體通過融合孔釋放到細胞質中[19]。總之，流感病毒HA介導病毒膜與核內體膜的融合過程：首先，HA被N端裂解至融合肽，從HA0到HA1和HA2的裂解對于在核內體發(fā)生的隨后的構象變化和允許融合肽暴露至關重要；其次，在融合過程中三聚體協同工作；第三，在出芽過程中，HA被分割成脂質微區(qū)，有助于后續(xù)的融合活性[20]。另外，流感病毒的包膜含有高水平的膽固醇，膽固醇的消耗嚴重影響病毒粒子感染細胞的能力。這種消耗可能直接影響病毒融合或病毒復制中的其他早期事件[21]。

2.4 脫殼和進入細胞核

流感病毒脫殼和進入細胞核在病毒生命周期中是必不可少的。病毒感染后30～90 min，大約30%的IAV顆粒在“周圍核”區(qū)域與晚期核內體融合脫殼。抑制病毒M2離子通道和核內體酸化可防止IAV脫殼。流感vRNP通過病毒HA分子和M2離子通道的協同作用從核內體釋放。HA介導的病毒膜與核內體膜融合后提供一條通道，與M1基質蛋白分離的vRNP可以通過該通道進入細胞質。M2通過酸化病毒粒子內部環(huán)境介導M1與vRNP的分離[22]。細胞質中的vRNP通過經典的α/β1輸入蛋白依賴性核導入途徑進入細胞核[23]。但秦沖等[24]報道，流感病毒脫殼后，vRNP分別釋放到細胞質中，單個的vRNP經歷3個階段的主動核導入過程，并在細胞核內呈現2種擴散模式。第一階段，vRNP 以0.34±0.07 μm/s的平均速度從“周圍核”區(qū)域移動到細胞核邊界；第二階段，vRNP通過振動運動與核膜結合并穿過核膜，整個過程持續(xù)33～89 s；第三階段，在細胞核內，vRNP進行快速和單向運動，以0.2～1.1 μm/s的瞬時速度歷經幾秒鐘到達核位點。但是，并非所有vRNP都能進入細胞核，完成轉錄和復制。

2.5 轉錄和復制

流感病毒在細胞核中進行轉錄和復制。流感病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）是由PA、PB1和PB2亞基組成的異三聚體，以病毒RNA（vRNA）為模板，在轉錄過程中合成細胞核中有帽狀、多聚腺苷酸化的mRNA，在復制過程中合成模板RNA（cRNA）和vRNA。以宿主pre-mRNA的5′帽子RNA片段為引物啟動轉錄，RdRp合成mRNA的啟動子分別位于vRNA的5′和3′末端，是分別由13和12個保守核苷酸組成的部分雙鏈螺旋RNA結構[25]。PB1亞基行使RNA聚合酶功能；PB2亞基結合細胞premRNA的5′帽子結構，形成有帽子的病毒mRNA；PA上的N端結構域切割5′帽子結構下游的10～13個核苷酸，產生帶帽子的RNA引物。然后將引物轉移到PB1亞基上的聚合酶活性位點，PB1將其作為引物，以病毒基因組作為模板合成帽狀mRNA，最后mRNA被多聚腺苷酸化[26-27]。vRNA的復制分2個階段，首先形成vRNA的cRNA，然后復制該cRNA產生vRNA。在此過程中，NP通過RNA結合和病毒聚合酶結合依賴性機制參與病毒基因組的復制。另外，NP是一種單泛素化蛋白，在體內可被USP11去泛素化。USP11的去泛素酶活性可以抑制流感病毒vRNA和cRNA的復制[28]。NP的泛素化位點為K184，K184突變NP可以抑制病毒基因組的復制[29]。

2.6 組裝和出芽

流感病毒顆粒的組裝、出芽和釋放是病毒生命周期的最后，關系著病毒的存活和致病能力。流感病毒的組裝和出芽需要幾個必不可少的步驟：①將所有病毒（亞病毒）成分帶到組裝位點，即非極化細胞的質膜或者極化上皮細胞的頂端質膜；②所有病毒成分必須有序地相互作用，才能組裝成具有傳染性的病毒粒子；③在組裝位點亞病毒成分相互作用使質膜向外彎曲啟動芽胞的形成；④在芽柄上附著的膜必須融合，使病毒顆粒從宿主細胞分離并釋放到細胞外環(huán)境中[30]。流感病毒都是在受感染的極化上皮細胞的頂端質膜組裝和出芽的。由于vRNP是在細胞核內合成的，因此必須先將vRNP從細胞核運輸到細胞質中，然后再轉運到極化上皮細胞的頂端質膜。M1是一種具有核定位信號的蛋白質，可以進入細胞核，與vRNP和NEP相互作用，形成一個（Crm1-RanGTP）-NEP-M1-vRNP“菊花鏈”復合物被運輸到細胞質中[31-32]。另外，病毒包膜蛋白（HA、NA和M2）也被運輸到病毒感染細胞的頂端質膜，在質膜上以離散的斑塊進行聚集組裝。病毒糖蛋白HA和NA參與出芽位點的選擇。Scheiffele等[33]對純化的流感病毒顆粒進行生化分析發(fā)現，HA和NA與具有脂質筏溶解特性的質膜相結合，流感病毒的出芽就發(fā)生在脂質筏結構上。形成的流感病毒顆粒通過膜分裂從細胞中釋放，NA裂解細胞表面唾液酸受體使病毒離開感染的細胞，釋放的流感病毒繼續(xù)感染其他細胞，至此流感病毒完成了一個完整的生命周期。被流感病毒感染的細胞發(fā)生死亡，死亡機制多種多樣，包括蛋白合成中斷和細胞凋亡等。由于病毒在細胞死亡前持續(xù)釋放數小時，許多呼吸道上皮細胞受到影響并在幾個復制周期內死亡。

總之，禽流感病毒和人流感病毒分別與細胞表面唾液酸α-2，3或α-2，6半乳糖受體結合，然后流感病毒以細胞骨架依賴的方式通過網格蛋白介導或網格蛋白和小窩蛋白非依賴的方式進行內吞。病毒粒子通過Rab5和Rab7陽性的早期和晚期核內體進行運輸，在低pH環(huán)境下，HA介導病毒膜與晚期核內體膜融合脫殼，釋放到細胞質中的不同vRNP片段分開進入細胞核，完成轉錄和復制，然后所有亞病毒成分在質膜完成組裝和出芽，最后釋放到周圍環(huán)境中。

最近感染高致病性禽流感病毒H5N1和H7N9病例的增加，引發(fā)了人們對流感病毒大流行潛力的擔憂。對流感病毒的生命周期進行綜述，有助于更好地理解流感病毒的致病機制，為更全面開發(fā)藥物的作用靶點提供參考。