奶牛副結核病例的臨床診斷

趙俊亮，吳建勇，葛建軍，王登峰*

（1.新疆呼圖壁種牛場有限公司，新疆 昌吉 831100；2.新疆畜牧科學院獸醫研究所（新疆畜牧科學院動物臨床醫學研究中心），烏魯木齊 830000）

副結核病是由副結核分枝桿菌（Mycobacterium paratuberculosis）感染引起的以頑固性腹瀉、漸進性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺褶為特征的慢性消化道疾病。該病又稱副結核性腸炎或約內氏病（Johne’s disease）[1]。副結核分枝桿菌可感染牛、羊、鹿等哺乳動物和鴿、斑鳩等鳥類。牛、綿羊、山羊等反芻動物易感，其中集約化養殖的奶牛和肉牛最為易感[2]。本病可通過糞口傳播方式由病畜傳染給人和其它動物，在我國被列為二類動物疫病[3]。

近年來，我們發現新疆一些牛場存在長期間歇性腹瀉、機體逐漸消瘦、反復治療無明顯改善的臨床病例，初步懷疑為副結核病病例，采集腹瀉糞便樣品，進行了實驗室相關檢測確診了感染的存在。本文就6例確診病例的臨床癥狀進行詳細描述以供獸醫臨床診斷時參考。

1 病例基本情況

經萋-尼氏抗酸染色和副結核分枝桿菌特異性基因IS900 PCR擴增[4]檢測確診的6例副結核臨床病例均為荷斯坦泌乳期奶牛，無特定發病時間，兩年內陸續發病，發病年齡在兩歲半至四歲半（30～52月齡）不等，初次發病時體況評分為3.1～3.4[5]，發生腹瀉前30 d的日均單產為25～38 kg（因所處泌乳階段不同，腹瀉前日單產量差異較大）。

2 臨床癥狀

發病牛產奶量驟然下降，下降幅度可達30%以上；早、晚體溫正常。

腹瀉，表現為軟便、排泄物稀薄、含有大量氣泡、水樣便呈噴射狀等不一。發病初期呈現間歇性，腹瀉2～6 d后停止，間隔5～20 d再次腹瀉，期間奶產量無恢復，體溫保持正常，精神狀態無顯著變化。腹瀉周期循環2～3次后，奶產量維持在腹瀉前的30%～60%，體溫正常，隨后再次出現腹瀉時癥狀加重，并且腹瀉周期縮短，表現頻繁腹瀉。初次發病3個月后，顯現出營養不良，消瘦，被毛雜亂，體況評分2.8～3.1。

3 實驗室確診

3.1 萋-尼氏抗酸染色

采取病牛的糞便，盡量采集含腸黏膜糞便，并采取集菌法處理，具體如下[6,7]：在采集的糞便中加3～5倍量0.5%氫氧化鈉攪拌均勻，在55℃水浴中乳化30 min形成均勻的糞便懸濁液，用4層紗布過濾，濾過液在 300×g離心 5 min，取上清液，去掉沉淀物，上清液再以1 700×g離心20 min，棄去上清，用沉淀物涂片，然后萋-尼氏抗酸染色，在油鏡下觀察可見成簇、團狀或叢狀紅染的細小菌團，菌體呈細短桿狀，可初步判定該菌為副結核分枝桿菌。

3.2 分子生物學檢測

按照“3.1萋-尼氏抗酸染色”的集菌方法富集細菌，少量生理鹽水重懸，調整pH值6.8～7.6，試劑盒提取DNA或者水煮法釋放細菌DNA，以Primer90/Primer91（Primer90：5’-GTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3’，Primer91：5’-GAGGTCGATCGCCCACGTGA-3’）為引物對副結核分枝桿菌特異性基因IS900進行PCR 擴增檢測，反應程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃ 3 min，30個循環；72℃ 7 min，擴增結果出現約340 bp的片段即確定為副結核分枝桿菌[4,8]。

4 小 結

副結核病的傳播速度緩慢，臨床上不同病例的出現間隔時間較長，易誤判為無關聯的或非傳染性的內科病。實際上在養殖場該病是一種傳播較為緩慢的地方流行性傳染病。該病主要感染幼畜，其中1月齡前最易感，最少在感染6個月以后才可能檢測到抗副結核分枝桿菌抗體，在2～5歲時部分感染牛才逐步表現出明顯的腹瀉癥狀[2]。根據副結核病的疾病發展進程，可分為臨床后期（持續大量排菌、腹瀉、消瘦、抗體陽性）、臨床期（間接性排菌、抗體陽性）、亞臨床期（部分牛可檢測到排菌和抗體）和隱蔽期（檢測不到排菌和抗體）。在副結核病流行的牛群中，這四期感染牛呈現著1：1-2：4-8：10-14的結構比例，表現出典型的“冰山現象”[9,10]。

該病的臨床診斷要點是：（1）2歲以上的腹瀉牛；（2）持續、頑固性腹瀉和慢性進行性消瘦；（3）出現腹瀉癥狀時，體溫無明顯變化，采食和精神狀態基本正常。

臨床后期和臨床期牛是本病的最主要的傳染源，此時，副結核分枝桿菌主要存在于病畜體內腸系膜淋巴結或腸黏膜，通過糞便大量排出，且對外界的抵抗力較強，可存活數月[2]。糞便中存在的副結核分枝桿菌可通過污染飲水、飼草料等方式，經消化道感染健康牛。一旦牛場出現確診的副結核病臨床病例，建議采用副結核分枝桿菌抗體檢測試劑盒對8月齡以上的牛進行3～4次/年的全面篩查，通過淘汰陽性牛等全場凈化措施控制副結核病的進一步擴散流行。