三維細胞培養的研究進展*

程 華，劉素生 綜述，韓 瑋 審校

(1.河北省科學院生物研究所，石家莊 050081；2.河北大學藥學院，河北保定 071002；3.河北省石家莊市第五醫院結核門診 050000)

細胞培養是指從生物體取出部分組織分散成單個細胞或直接從機體取出單個細胞，在體外條件下培養，細胞能繼續存活與增殖。從1885年德國學者ROUX用生理鹽水培養雞胚組織開始算起，細胞培養技術發展到今天已有一百三十多年的歷史了。在這一百多年里細胞培養技術不斷發展，特別是20世紀60年代末期培養技術進入鼎盛階段，在培養器皿、培養液和培養方法等方面取得突破性進展。由于操作簡單、周期短、費用低等特點，細胞培養在基礎研究和應用領域中使用越來越廣泛[1]。

經過多年的發展，細胞培養技術已成為生命科學研究、疾病機制研究、藥物篩選及生物制品生產等多個領域中基礎且不可替代的技術手段[2]。在腫瘤機制研究方面，通過在體外進行腫瘤細胞培養的方式，來揭示腫瘤發生、發展及轉移過程中分子調控行為和機制[3]。在藥物篩選方面，外源化合物可以直接作用于靶細胞，特別是大量候選藥物的初始篩選階段，可以根據篩選目的設計實驗條件，短期內獲得大量包括藥物反應和細胞毒性在內的實驗數據。同時，標準化的細胞培養流程使得自動化設備的使用成為可能，效率大大提高[4-5]。在生物制品方面，目前多種疫苗由細胞發酵生產，特別是流感疫苗，細胞培養已經成為其最主要的生產方式之一[6-7]。

隨著各領域研究的不斷深入，二維細胞培養技術的缺點也逐漸暴露出來。在很多情況下某些細胞在培養過程中逐漸喪失了原有的特性，導致研究結果與體內的實際情況不符合。分析其原因，考慮細胞在體外進行二維培養時，無法生成細胞外基質(extracellular matrix,ECM)，進而無法形成立體結構。而在活體組織中，細胞通常在三維微環境中生長，這個三維微環境提供了細胞生存所需的各種條件，在物理方面起到支撐作用。在化學方面則是氧氣等多種氣體的傳遞、各種糖類營養物質的代謝及各種激素等信號分子的傳導。所以空間結構和外部的微環境對于細胞的形狀、增殖、分化和遷移等具有至關重要的作用[8]。

因此如何填補單層細胞培養和生物活體間的鴻溝，為細胞提供與體內相似的支架系統，創造與體內相似的生長環境，促使細胞增殖、分化及呈現出類似體內的功能成為體外細胞培養技術迫切需要解決的難題和發展趨勢[9]。近幾年，隨著組織工程的發展，三維細胞培養應運而生。

1 三維細胞培養的出現

1972年，ELSDALE等[10]發現細胞在含有細胞外基質的三維空間中生長時，表現出與在平面生長中不同的特性。這一發現引起了研究人員極大的興趣，隨之相關的研究逐漸展開[11]。三維細胞培養是指將不同種類的細胞培養在不同三維結構的載體中，使細胞能夠在載體的空間結構中增殖和分化，構成細胞-載體復合物[12]。三維細胞培養作為體外單層細胞培養和體內天然生長環境的橋梁，具有傳統單層細胞培養不可比擬的優勢，既能創造體內細胞微環境的物質及結構基礎,使得細胞在形態學、基因表達及其他生理過程中都更接近于體內的狀況，同時又具有細胞培養的直觀性及條件可控性的優勢。

2 三維細胞培養的模式

實現三維細胞培養，目前有兩種常用模式，第1個是細胞懸浮培養，第2個是三維支架培養。細胞懸浮培養是指在懸浮條件下細胞逐漸聚集，經過數天培養后形成一個直徑數百微米的多細胞球狀體。這種培養模式操作簡單、費用低，已經被廣泛應用于多種研究中。VINCI等[13]對40種不同的腫瘤細胞系(包括肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌和前列腺癌等)進行了細胞懸浮培養，發現球狀體的形成大致可以分為3種，即緊密的規則球形、緊湊的不太規則球形和松散的不規則球形。其中后兩種類型可以通過往培養基中加入一定量的細胞外基質而改善球形結構。雖然細胞懸浮培養操作簡單，但用途較為單一，不能用于細胞的遷移研究等。

三維支架培養則是將細胞培養在具有空間結構的支架上，該模式關鍵在于細胞空間支架的獲得。這些支架在生物體內由細胞外基質構成，主要成分是細胞膜外蛋白和多糖類物質[14]。其中蛋白主要是膠原蛋白和層粘連蛋白，多糖類物質則主要是糖胺聚糖，包括硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素等。在體外構建和體內相同的三維支架非常困難，因為這涉及高分子合成、表面修飾、生物耦聯、細胞生物學等多個學科和領域。經過多年的研究這一領域已經取得了一些進展，目前可用于制備三維支架的材料主要來自純天然及人工合成。

其中純天然的材料有膠原蛋白、水凝膠、層粘連蛋白及透明質酸等[15-17]。這些材料是從植物、動物及人體組織中提取出來的，與生物體內的細胞外基質相似或完全相同，具有非常好的生物相容性，不容易引起細胞的排異反應。但天然材料也有一些缺點，如提取困難、整體質量較難控制等。

人工合成的三維支架材料有聚苯乙烯、聚己內酯、聚乳酸和聚乙二醇等[18-20]。這些合成材料具有良好的可塑性，生物化學及物理特性，以及高度的穩定性。但其生物相容性稍差，有可能引起細胞的排異反應。

3 三維與二維細胞培養的區別

由于培養條件等諸多因素的改變，同一種細胞在三維與二維細胞培養下，其形狀、基因的表達及細胞侵襲等特性都有可能發生改變。LI等[21]用芯片比較了平滑肌細胞9 600個基因在三維及二維細胞培養的表達差異，發現至少有77個基因在三維細胞培養的表達水平比二維細胞培養高一倍以上。除了上述基因表達的差異外，在兩種不同的培養模式下，細胞在形狀、培養花費、細胞間相互作用及細胞耐藥性方面都表現出了巨大的差異[13-20]。

4 三維細胞培養在腫瘤研究中的應用

細胞培養技術在研究腫瘤發生、發展、轉移、侵襲及壞死過程中的機制和分子調控行為具有重要的作用，隨著三維細胞培養的出現，腫瘤(特別是實體瘤)相關研究進入一個更高的水平。因為在三維細胞培養過程中，細胞增殖趨于緩慢，氧氣和營養物質的傳遞遞減會形成一個中空的核心，這與體內的腫瘤組織非常相似。

目前在癌癥研究中，三維細胞培養主要應用于腫瘤切片培養物、腫瘤芯片及單細胞或多細胞共培養的多細胞腫瘤球體等方面[22]。腫瘤切片培養首先是組織標本的機械分離，即小的活檢組織或切碎的患者組織標本被培養在細胞外基質中。KOERFER等[23]利用這一技術從胃癌患者的組織中剪下400 μm大小的標本塊，在體外培養了6 d。發現該培養技術能夠很好地保存腫瘤細胞的組織形態完整性。在對該組織塊進行5氟尿嘧啶和順鉑處理后，觀察到腫瘤細胞的失活和細胞凋亡的增加。其認為三維細胞培養可用于檢測藥物的細胞毒性，也可用于研究細胞的耐藥機制。

MAGUIRE等[24]對多個乳腺癌MCF10細胞株進行三維細胞培養，然后對基因組和轉錄組進行測序，發現在多個基因的拷貝數上，各個細胞株存在很大的差別。SIMON等[25]利用三維細胞培養來研究肺癌A549細胞的3個不同亞型對電離輻射的代謝反應。對培養在一種水凝膠中的細胞進行電離輻射，然后對氧氣和營養物質的可用性進行分析。隨著細胞與培養結構表面距離增加，缺氧誘導因子1-α水平增加、細胞增殖減少，細胞對電離輻射的敏感性降低。這些反應與實體瘤中觀察到的癌細胞的特征非常相似。

STRATMANN等[26]利用三維培養模式來研究肺癌HCC827細胞系對表皮生長因子受體抑制劑吉非替尼敏感性的變化情況，發現HCC827細胞中表皮生長因子受體的活性會被吉非替尼所抑制，從而導致細胞增殖的停滯及細胞凋亡的增加。該學者還研究了三維細胞培養下表皮生長因子受體信號網絡中多個基因的變化情況，以及上皮-間質細胞轉化過程中涉及的纖維蛋白、E-鈣黏蛋白等的表達水平變化。找到了在三維模式下對腫瘤的增殖、凋亡和侵襲進行定量測定的一些指標，初步實現了定量測定。在腫瘤干細胞轉化為腫瘤細胞的過程中，細胞微環境特別是細胞外基質被認為起了重要調節作用，為了探索這一過程，MA等[27]將膠質母細胞瘤U251細胞系培養在以聚苯乙烯作為基底，上面覆蓋有多種黏連蛋白的三維空間骨架上。通過檢測與干細胞特性相關的基因和蛋白的表達水平，發現由二維變為三維細胞培養后，一些干性標志物有增高的趨勢，如層粘連蛋白結合整合素α6和β4有上調。這一系列試驗結果表明，細胞微環境與腫瘤干細胞的干性關系緊密。

5 三維細胞培養在藥物篩選中的應用

在候選藥物的初始篩選階段，利用體外試驗來研究藥物對細胞的作用是一種被廣泛接受的方法。其主要目的是檢測藥物對靶細胞造成的損傷程度及其安全性。候選藥物在靶細胞中造成的損傷程度可以指示其治療價值，而安全性測試提供了可能的副作用和一些不可預測的結果。由于在三維細胞培養下細胞在形態學、基因表達及其他生理過程中都更接近于體內的狀況，所以利用三維細胞培養進行藥物的篩選其效率將大大提高。

MARINHO等[28]對大鼠原代肝細胞進行三維細胞培養來研究奈韋拉平及其代謝物對PON1酶的作用。發現在三維細胞培養下，該藥物可以增強內脂酶、對氧磷脂酶及芳基脂酶的功能。LABONIA等[29]使用3D打印的微流控裝置來進行三維細胞培養，用以研究伊立替康及其活性代謝物SN-38在實體腫瘤中滲透及代謝途徑，而這一過程用二維細胞培養是無法做到的。LV等[30]使用三維膠原蛋白骨架來培養神經膠質瘤細胞，發現腫瘤干細胞的數量增加，同時細胞O6甲基鳥嘌呤脫氧核糖核酸甲基轉移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)表達水平上升及對烷化類化療藥物的耐藥性增加。其中耐藥性的表現與腫瘤患者的狀況十分接近，表明三維細胞培養用于抗神經膠質瘤藥物的篩選時，效果更好。

BRESLIN等[31]研究了BT474、HCC1954及EFM192A的3種不同Her-2陽性乳腺癌細胞系在三維細胞培養條件下對來那替尼的反應、代謝及耐藥性。為了提高三維細胞培養條件下的藥物篩選速度，研究人員進行了一系列的改進。結果發現與二維細胞培養比較，三維細胞培養的細胞存活及轉移相關蛋白如CYP3A4等表達均有不同的升高，考慮這些變化可能導致細胞對來那替尼的耐藥性增強了。EICHLER等[32]發明了一種三維細胞培養與電阻檢測相結合的辦法，來篩選抗腫瘤藥物。具體過程是先將神經母細胞瘤SHSY5Y細胞培養在150～250 μm的三維骨架中，再將這些細胞團轉移到含有候選藥物的培養基中，特定時間點取出進行多個指標的檢測。該篩選方法非常高效，每天可檢測800個細胞團。

RASHEENA等[33]分別用Matrigel、Cultrex及Alvetex 3種不用的三維細胞骨架進行前列腺癌LNCaP和DU145細胞系的培養，以檢測兩種細胞系對多烯紫杉醇和雷帕霉素的敏感性及耐藥性。結果顯示兩種細胞在3個不同的三維細胞培養條件中的生長速率各不相同，耐藥性也不一致。DU145中表皮生長因子受體的表達與雷帕霉素的耐藥性呈負相關，LNCaP中則是p53蛋白二聚體的表達與多烯紫杉醇的耐藥性呈正相關。這些結果表明，目前三維細胞培養對細胞的行為具有非常大的影響，為了保證數據的可靠性和準確性，應盡快建立統一的三維細胞培養標準。

6 結語與展望

三維細胞培養作為體外單層細胞培養與體內研究的橋梁，具有細胞培養的直觀性及條件可控性的優勢，同時能最大程度地模擬體內細胞微環境。這些優點使得三維細胞培養迅速被應用于生命科學、腫瘤機制研究及藥物篩選，但該技術仍然有許多不足的地方，包括標準不統一、使用成本較高、細胞觀察不便等。相信隨著相關技術的發展，這些問題將逐步被解決，三維細胞培養將獲得更為廣泛的應用。