脫落乳牙牙髓干細胞的生物學特性及應用

向進瓊

福建師范大學 生命科學學院，福建省發育與神經生物學重點實驗室，福建 福州350108

干細胞被定義為具有自我更新和多向分化能力的克隆細胞，負責損傷后正常組織的更新、愈合和再生[1]。長期以來，干細胞一直吸引著科學家的注意，科學家們對干細胞進行了大量的研究，基于干細胞的組織工程也是一種很有前途的方法[2-3]。根據干細胞所在發育階段的不同，干細胞被分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細胞（adult stem cell，ASC）。雖然與ESC 相比，來源于成體組織的ASC 分化潛能更小，但這些細胞倫理問題較少，因此人們對源自成體組織的干細胞的研究越來越感興趣。這些成體干細胞現已從各種組織中分離出來，如骨髓、大腦、脂肪、皮膚、神經和牙齒組織等[2]。與從其他組織中獲取干細胞相比，牙源性干細胞的獲取及儲存既簡單又方便，已成為研究熱點。來自恒牙髓組織、乳牙髓組織和多生牙髓組織的干細胞，其特異性表面標記物和分化潛能各不相同[4]。據報道，脫落乳牙牙髓干細胞（stem cells from hu?man exfoliated deciduous teeth，SHED）在多能性和增殖能力方面似乎是效果最好的細胞[5]。

2003年，Miura[6]等首次分離出SHED，發現與牙髓干細胞（DPSC）和骨髓間充質干細胞（BMMSC）相比，SHED具有更高的增殖率和群體倍增值。此外，SHED是從脫落乳牙的殘留牙髓中分離出來的，因此無須倫理考慮就可以輕易獲得。乳牙向恒牙的過渡是一個非常獨特和動態的過程，乳牙的牙髓在出生前就已存在，一直維持到恒牙萌出前，在這個時期，這些干細胞尚未受到遺傳或環境因素累積效應的嚴重影響[7]。SHED也可以在體外和體內分化為成骨細胞、肝細胞、肌細胞、成牙本質細胞、軟骨細胞、脂肪細胞以及皮膚和神經細胞等[6,8-9]。由此可見，SHED具有多種優勢，有廣闊的應用前景。

1 脫落乳牙牙髓干細胞

1.1 脫落乳牙牙髓干細胞的特征

SHED表現出多種間充質干細胞特性，例如具有典型的成纖維細胞樣形態學特征、克隆性、細胞表面抗原表達、細胞增殖能力和多向分化潛能[6]。表型分析顯示SHED表達多種間充質標記物，如CD105、CD90、CD146、CD166、CD117、CD105、CD73、CD71、CD44、CD29、CD10和SSEA-4，但不表達CD34、CD197、CD184、CD133、CD106、CD63、CD49e、CD45、CD31、CD7和HLA-DR[6,10-15]。這些結果證明SHED非造血多能干細胞，因為它對造血干細胞標記物CD34表達呈陰性。此外，與DPSC 相比，SHED高表達CD117和CD105，說明SHED更不成熟，且應該具有更好的分化潛能[10]。與DPSC和BMMSC 相比，SHED生長穩定，具有更高的增殖活性，SHED表達更多與細胞增殖和細胞外基質相關途徑的基因，例如成纖維細胞生長因子和腫瘤生長因子β[16-18]。

除了具有間充質干細胞的特性，SHED還顯示出與BMMSC 類似的強大的免疫調節功能。與BMMSC 相比，SHED在上調Treg和Th17細胞比例方面表現出更顯著的效果[19]。在體外，SHED顯著抑制Th17 活性，還能有效逆轉MRL/lpr 小鼠中的系統性紅斑狼瘡相關病癥[19]。Dai[20]等研究表明，SHED減少了鼻腔炎癥，并糾正了變應性鼻炎小鼠模型中的CD4+T細胞免疫失衡，通過誘導Treg細胞的擴增來抑制T 淋巴細胞的增殖并增加Th1/Th2的比例。這些結果表明SHED具有良好的免疫調節能力。

1.2 脫落乳牙牙髓干細胞的多能性

1.2.1 成骨分化 成骨誘導分化后，SHED會表達多種骨標記物，如核心結合因子、堿性磷酸酶、細胞外基質磷酸糖蛋白、骨涎蛋白、骨鈣蛋白和成骨細胞標志物Osterix 等[6-7,19-21]。SHED是一種潛在的成骨細胞來源，其成骨分化潛能大于DPSC，但與BMMSC 相比較低[22]。近年來，已發現多種物質能夠影響SHED的成骨分化能力。Liu[23]等以硼酸鎂和硼酸鋅作為誘導劑培養SHED，21 d后發現其成骨細胞分化明顯，分化細胞鈣礦物大量沉積，并表達多種骨相關基因，如堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、Runx2、骨鈣素、骨橋素、血管內皮生長因子和血管生成素1。證實硼酸鎂和硼酸鋅是成骨細胞分化的重要誘導因子，這些二價金屬離子和B離子可以從支架中釋放到培養基中，促進細胞的成骨分化。當在成骨誘導培養基中加入白細胞介素6后，SHED堿性磷酸酶的表達顯著上調，礦物沉積也明顯增多，與磷酸鹽代謝相關的基因也發生了顯著變化。說明白細胞介素6 能提高SHED的礦化能力，誘導骨向分化[24]。在含CoCl2的成骨誘導培養基中培養的SHED，其成骨相關基因的表達則會被抑制，堿性磷酸酶活性和鈣沉積均呈劑量性降低，說明CoCl2抑制了SHED的成骨分化[25]。由于其成骨分化潛能，SHED成為骨再生工程研究中重要的細胞來源。

1.2.2 成脂分化 已有研究表明，SHED具有向脂肪細胞分化的能力。用脂肪誘導混合物培養SHED可以使其向脂肪細胞分化，并使PPAR-γ和脂蛋白脂肪酶（2種脂肪細胞特異性標記物）的表達上調，油紅O 染色結果也證實了SHED的成脂分化[6,26-28]。與DPSC 相比，SHED的成脂分化能力更高。然而，與BMMSC 相比，SHED脂肪形成分化明顯降低，表現為脂質特異性油紅O 陽性細胞數量減少以及PPARγ2和脂蛋白脂肪酶的表達減少[19]。相反的是，Pivoriuūnas[29]等在一項評估分化的研究中發現SHED具有強烈的成骨分化能力，但沒有脂肪形成潛力。

1.2.3 成軟骨分化 利用含有ITS、抗壞血酸、丙酮酸鈉、脯氨酸、地塞米松、胎牛血清、TGF-β、BMP-6、青霉素和鏈霉素成分的誘導混合物，可以使SHED在體外發育成軟骨細胞[8]。Chen[30]等的研究也證明，SHED在包含地塞米松、胰島素、維生素C、TGF-β3和成纖維細胞生長因子的成軟骨分化培養基中培養2周可以分化為軟骨樣細胞。此外，將SHED與β-TCP 支架混合植入裸鼠背部皮下，SHED表現出克隆形成能力和軟骨向分化。Koyama[31]等發現，在用BMP-2 處理的SHED和DPSC的微團培養物中均出現軟骨細胞結節，但DPSC 中軟骨形成標志物（Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原和Sox9）的水平顯著低于SHED。

1.2.4 成牙分化 Miura[6]等的研究證明SHED在體內和體外都能夠分化為成牙本質樣細胞。但Gronthos[32]等報道，它還不能再生如DPSC 中所見的牙髓-牙本質復合體。另外，SHED表達BMP 受體，在牙片/支架中培養的SHED中阻斷BMP-2 信號通路會抑制成牙細胞分化標志物表達，表明牙本質衍生的BMP-2 是誘導SHED成牙本質細胞分化所必需的[33]。Sakai[34]等將SHED植入牙片/支架材料皮下植入小鼠背部32 d后，牙片髓腔向心形成牙髓樣組織，包括牙本質小管和前牙本質。這些組織中牙本質涎磷蛋白、牙本質基質蛋白1 等成牙本質分化標志物表達呈陽性，表明SHED具有分化成功能齊全的成牙本質細胞的能力，這些成牙本質細胞能夠在體內沉積類似于牙本質的礦化結構。

1.2.5 成神經分化 大量研究表明，SHED在非神經誘導條件下會表達神經標志物，包括巢蛋白、β-3 微管蛋白、谷氨酸脫羧酶、神經元特異性核蛋白、膠質纖維酸性蛋白、神經絲蛋白和2，3-環核苷酸-3-磷酸二酯酶，這可能是由于牙髓起源于神經嵴[6,35]。Nourbakhsh[36]等將神經誘導劑bFGF 加入培養基中培養SHED，5 d后發現細胞逐漸失去間充質外觀，表現出更多的神經樣細胞外觀，包括神經元樣生長，進一步添加SHH/FGF8 可使細胞具有細長和精細的軸突或樹突樣結構。Su[37]等研究證實，SHED在神經誘導培養條件下，不僅表達早期神經標記物巢蛋白，同時也表達晚期標記物神經元特異性烯醇化酶和神經膠質細胞標記物膠質纖維酸性蛋白及2，3-環核苷酸-3-磷酸二酯酶。此外，SHED在三維殼聚糖導管和動態培養系統條件下，神經向分化能力增強，特別是膠質纖維酸性蛋白和2，3-環核苷酸-3-磷酸二酯酶的基因表達分別增加了28倍和53倍[37]。這些結果表明，在離體培養條件下，SHED可分化為功能性神經膠質細胞。用神經營養素腦源性神經營養因子、神經營養素3和膠質細胞源性神經營養因子處理SHED，2周后其形態發生變化，并表達β-3 微管蛋白、GATA 結合蛋白3、原肌球蛋白受體激酶B，說明SHED也可以分化為螺旋神經節樣神經元細胞[15]。

1.2.6 成肝細胞分化在添加了肝細胞生長因子和抑瘤素M的無血清培養基中，SHED的形態從成纖維細胞樣向卵圓肝細胞樣細胞轉變。在分化和成熟28 d后，細胞表達與肝細胞相關的標志物白蛋白、甲胎蛋白、胰島素樣生長因子1、肝細胞核因子4α和氨基甲酰磷酸合成酶1[38]。該結果表明SHED具有向肝細胞分化的潛力。Ishkitiev[39]檢測了硫化氫對肝細胞分化的影響，發現在暴露于硫化氫的測試組中，肝細胞相關標記物比在對照組中表達更多，尿素和糖原的產生也有所增加。隨后，Su[40]等發現在含有甘草和當歸提取物的培養基中培養的SHED在甲胎蛋白和白蛋白的表達上呈陽性，證實甘草、當歸等中草藥可誘導SHED向肝細胞分化。

2 脫落乳牙牙髓干細胞的應用

2.1 骨再生

許多體內研究報道了SHED在人工創造的顱蓋缺損中的骨再生的適用性。de Mandonca[41]等發現SHED和膠原膜在顱骨骨缺損中誘導新骨形成，并在大鼠中形成板層骨。SHED與HA/TCP 支架移植能夠誘導免疫缺陷小鼠顱骨骨缺損關鍵部位的骨再生，再生組織含有大量人類骨骼結構和骨髓樣成分[42]。在Nakajima[43]的研究中，PLGA膜與SHED的移植也誘導了顱骨缺損中新骨的形成，而且SHED移植與hDPSC和hBMSC 移植產生的新骨量大致相同。然而，在Behnia[44]等進行的研究中，SHED與膠原支架移植的部位和僅僅用膠原支架移植的對照組相比，缺損下頜骨中骨再生沒有明顯差別，在缺損的舌側和底部再生的骨組織都是致密的。在骨質疏松癥小鼠模型中，靜脈注射SHED能夠增加骨密度并恢復骨小梁結構，與對照組相比，注射SHED的實驗組中表達更高水平的成骨細胞特異性基因Runx2、堿性磷酸酶和骨鈣蛋白[45]。Lee[46]等把SHED細胞培養膜片植入腭突，體外培養后發現表達骨特異性成骨標記物Osterix、骨鈣素和骨橋蛋白，證明SHED細胞培養膜片具有礦化潛能。這些研究結果均表明SHED是一種理想的骨組織工程的來源。

2.2 牙髓修復

將SHED與可注射支架移植到人前磨牙根管中，體外培養后可表達成牙本質細胞分化的標記基因[47]。另外，將此根管移植到免疫缺陷小鼠皮下，發現在體內的全長根管中產生功能性牙髓。與對照人牙髓相比，使用可注射支架與SHED產生的牙髓組織呈現相似的細胞性和血管形成[47]。這些研究證實SHED具有在體內生成牙髓樣組織的能力，表明其在牙髓組織工程中的潛在應用。

2.3 神經再生

SHED具有顯著的神經再生活性，可促進脊髓損傷后的功能恢復。Sakai[11]等將DPSC和SHED移植到脊髓損傷大鼠模型中，移植的DPSC 或SHED明顯提高了后肢運動功能的恢復，并且移植的SHED抑制了神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的凋亡，從而在損傷的中心周圍區域中保留了神經絲和髓鞘。SHED在體內進行神經源性分化的潛力，為利用這些細胞作為替代模型治療不同的神經相關疾病提供了可能。

2.4 疾病治療

通過脾臟將SHED移植到CCl4誘導的肝纖維化模型小鼠體內，發現SHED明顯恢復了肝功能障礙，并使受體肝臟產生抗纖維化和抗炎作用，SHED直接轉化為肝細胞而不發生細胞融合[48]。Yokoyama[49]的研究證明，將來源于SHED的肝樣細胞移植到CCl4誘導的肝硬化大鼠中，肝硬化大鼠肝臟再生，該病癥明顯恢復。因此，使用SHED來治療肝疾病也可能是一個有效的選擇。Rao[50]等研究表明，SHED對Goto-Kakizaki 大鼠中二型糖尿病有改善作用。在尾靜脈注射SHED后8周，SHED顯著逆轉了糖尿病誘導的G-6-Pase、Pck1和PK的增加和糖尿病誘導的GSK3β、GLUT2和PFKL的減少，胰島和肝臟的損傷也得到改善[50]。將來源于SHED的細胞外囊泡經鼻腔給藥帕金森疾病模型小鼠后，發現此細胞外囊泡能有效逆轉步態障礙，使SN和紋狀體TH表達正常化，延緩疾病的進展，減輕帕金森患者的殘疾[51]。

3 結語

SHED代表了不成熟的干細胞群，是一種易獲得、低侵襲性的間充質干細胞，可以很容易地在體外分離、培養和擴增，并分化為多種細胞。SHED長期冷凍保存后仍可保持未分化和穩定性，也不影響其生物學和免疫學特性。SHED的這些特性使其成為組織工程和干細胞治療的最有價值的來源。基于干細胞的牙齒再生顯示出潛在的臨床應用。隨著科學技術的飛速發展，牙齒干細胞的研究將為組織工程和再生醫學開辟更廣闊的應用前景。