microRNAs調節腦卒中后血腦屏障的研究進展

楊佳蕾，張秀芬，吳詩坡，侯利華，尹世敏

1.解放軍火箭軍特色醫學中心，全軍腦卒中醫療救治研究中心神經內科，北京100088；2.解放軍總醫院 海南醫院婦產科，海南 三亞572013；3.軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京100071；4.國家神經系統疾病臨床醫學研究中心，北京100070

血腦屏障是指腦血管內皮細胞、星形膠質細胞足突、周細胞及基膜組成的血液與腦組織之間的屏障，對保持腦組織內環境的穩定、調節腦組織的營養與代謝、維持中樞神經系統正常生理功能有重要意義[1]。在眾多中樞神經系統疾病中，如腦卒中、阿爾茲海默癥、腦外傷、腦腫瘤、腦小血管病，血腦屏障的結構及功能往往遭到破壞，導致腦組織炎性細胞浸潤、腦水腫及脫髓鞘、氧化自由基損傷、神經元變性及神經細胞死亡[2-3]。作為我國居民第一位死亡原因，腦卒中具有高發病率、高致殘率、高復發率的特點，探討如何有效挽救受損血腦屏障，減輕或修復腦卒中后神經系統的損傷，具有重要的臨床意義。microRNA（miRNA）是一類由19～24個核苷酸組成的非編碼RNA，在神經系統發育過程中起重要的調控作用，如調節神經干細胞增殖、神經元及神經膠質細胞分化[4]。腦卒中后miRNA表達譜發生變化，上調其中的保護性miRNA或下調損傷性miRNA可以起到抗炎、抗凋亡、促進血管生成、促進神經再生的作用，提示miRNA不但是影響腦卒中病理生理過程的關鍵分子，而且可以作為藥物干預靶點[5]。本文對miRNA調節腦卒中后血腦屏障的研究進展進行綜述，以期為保護血腦屏障、減輕腦損傷、改善預后提供新的干預靶點。

1 血腦屏障

血腦屏障是外源物質進入中樞神經系統的第一道屏障，對進出腦組織的物質有濾過和篩選作用，對維持腦組織內環境的穩定有重要意義。腦血管內皮細胞之間位于頂部的緊密連接使內皮細胞形成完整的屏障界面，與細胞底部的黏附連接共同組成連接復合體。緊密連接蛋白主要包括閉合蛋白（occludins）、密封蛋白（claudins）以及輔助蛋白ZO 等，黏附蛋白主要為鈣黏著蛋白（cadherins）。內皮細胞外周的基膜對內皮細胞起支撐保護作用，主要由膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等構成[6]。任何損傷血腦屏障結構的疾病，如腦卒中、阿爾茲海默癥、腦外傷、腦腫瘤、腦小血管病，都可以導致內皮細胞間緊密連接開放、基膜被基質金屬蛋白酶（MMP）消化崩解、星形膠質細胞足突回縮、血腦屏障通透性增加，繼而引發炎癥細胞浸潤以及大量炎性因子釋放、血管源性以及細胞源性水腫、神經細胞死亡以及神經功能障礙[7]。

2 miRNA

miRNA是一類序列高度保守的非編碼RNA，其生物合成是一個多步驟過程。在RNA 聚合酶的作用下，DNA 轉錄為可長達幾千堿基的PrimiRNA，接著由Drosha 復合物剪切成65～75個核苷酸、具有莖環結構的Pre-miRNA；Pre-miRNA被輸出蛋白從細胞核轉運到細胞漿，然后被Dicer 識別并對莖環結構進行剪切，形成具有功能的成熟單鏈miRNA。miRNA雖然短小，但是卻可以通過堿基配對原則與靶基因的mRNA 3'非翻譯區（3'UTR）結合，抑制靶基因mRNA的翻譯，導致靶蛋白產量減少，在細胞代謝、增殖、分化、死亡等各個生命活動中發揮重要的調控作用。一個miRNA可以有多個靶基因，一個基因也可以受到多個miRNA的影響，從而構成交錯復雜的調控網絡。理論上，人類基因中可能有超過三分之一的基因受到miRNA調控[8]。在病理過程中，miRNA表達譜發生變化，越來越多的研究關注到miRNA作為生物標志物在疾病早期診斷、判斷疾病分期與病情輕重、監測治療效果與評價新療法中的作用。對miRNA在疾病過程中發揮的作用以及調控機制進行深入研究，將有助于發現更多更優的診治靶點[5]。

3 miRNA與腦卒中

腦卒中是一種導致神經功能障礙的血管性中樞神經系統疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中。缺血性腦卒中較出血性腦卒中更常見，占腦卒中人群的70%～80%。腦組織缺血缺氧可以導致腦血管內皮功能障礙，內皮細胞間的緊密連接受到破壞，導致血管源性水腫，血腦屏障通透性發生改變，炎性因子浸潤、基質金屬蛋白酶及環氧合酶激活、活性氧自由基的產生都影響著腦卒中后血腦屏障損傷的病理進程[9]。而在此過程中，miRNA表達譜發生變化，進而通過調節下游分子的表達影響該病理過程[10]。

3.1 miRNA與缺血性腦卒中

在缺血性腦卒中后，腦血管內皮細胞的緊密連接往往首先受到影響，miRNA則可以通過影響緊密連接相關蛋白（如ZO-1、閉合蛋白和密封蛋白等）影響血腦屏障通透性。既往研究報道，在體外原代培養人腦血管內皮并制作氧糖剝奪模型，通過轉染miR-155 抑制劑或miR-155，可以調節單層血管內皮電阻和通透性，轉染miR-155 抑制劑組可以顯著提高Claudin-1、ZO-1 等緊密連接蛋白水平，而轉染miR-155 組則可以降低上述緊密蛋白表達[11]。除了體外研究，在體研究也得到近似結果。給大腦中動脈遠端梗阻（dMCAO）的腦梗塞小鼠經靜脈注射miR-155 抑制劑，可以顯著提高缺血損傷區邊沿血流灌注以及微循環血管的完整性，電鏡檢測觀察到注射miR-155 抑制劑的小鼠在腦梗塞后毛細血管的緊密破壞減少，頭顱核磁檢測發現腦梗塞損傷區體積也較對照組顯著減少。進一步研究發現，miR-155 通過調控其靶蛋白Rheb 穩定了緊密連接相關蛋白ZO-1，從而發揮保護血腦屏障的作用[12]。miR-210 也可以負性調控血腦屏障完整性，經側腦室注射miR-210 導致腦水腫以及IgG 蛋白向腦實質滲透。機制研究發現，miR-210 可以結合在閉合蛋白以及β連環素（β-catenin）mRNA的3'UTR端，降低上述蛋白表達水平，而抑制miR-210 則起到保護性作用[13]。除了影響緊密連接相關蛋白，miRNA也可以通過調節細胞線粒體能量供應影響血腦屏障完整性。例如miR-34a 可以減少線粒體氧化磷酸化和三磷酸腺苷的產生，在血管內皮細胞過表達miR-34a 可以抑制線粒體功能、影響緊密連接蛋白分布、增加血腦屏障通透性[14]。類似miR-155、miR-210、miR-34a、miR-143[15]、miR-150[16]也對血腦屏障的通透性產生負性調控，這也提示抑制負性miRNA有可能成為保護血腦屏障的治療方法。

然而，也有一些miRNA可以通過多種機制維持血腦屏障完整性。例如，在缺血性腦卒中后血液中及腦組織中miR-132表達水平發生變化，給大腦中動脈栓塞（MCAO）小鼠經側腦室注射miR-132 可以顯著減輕腦梗塞損傷、改善神經功能預后。進一步機制分析提示，miR-132 可以通過抑制其靶蛋白MMP9 減少緊密連接蛋白VE-鈣黏著蛋白及β連環素的降解[17]。與之相似，miR-539在腦缺血再灌注模型中表達量降低，而其靶蛋白MMP-9表達含量增高導致血腦屏障破壞。在體外培養內皮細胞并制作氧糖剝奪模型，通過添加外源性miR-593 可以顯著改善氧糖剝奪導致的內皮損傷[18]。miR-21 不僅在腦外傷動物模型中被檢測到促進內皮細胞緊密連接、穩定血腦屏障[19-20]，還有報道miR-21 可以通過結合MAP2K3的3'UTR 降低腦梗塞后血腦屏障通透性、減少損傷區體積、減輕水腫并改善神經功能[21]。

3.2 miRNA與出血性腦卒中

盡管出血性腦卒中的發病率低于缺血性腦卒中，但出血性腦卒中患者腦血管破裂導致血液進入腦實質，可以引起顯著的腦腫脹、顱高壓、神經功能障礙，出血性腦卒中的死亡率、致殘率往往較高，研究其神經保護策略有重要的臨床意義。既往研究報道，腦出血患者血漿中miR-126、miR-146a和miR-let-7a 等miRNAs表達水平降低，其中miR-126表達水平與預后情況負相關[22]。miR-126 有2種成熟剪切形式，分別為miR-126-3p和miR-126-5p。miR-126-3p 可以通過負性調控PIK3R2 影響血管生成及血管內皮完整性[23-24]。在腦出血大鼠模型中，經側腦室定位補充外源性miR-126-3p 可以減輕腦水腫，抑制炎癥細胞浸潤以及小膠質細胞激活[22]。miR-132 不僅在缺血性腦卒中過程中對血腦屏障有保護作用，有研究發現其在出血性腦卒中中同樣有保護效力[25]。該研究采用自體血腦出血模型，用慢病毒表達miR-132 并定位注射到尾狀核，結果發現與對照組相比，外源性表達miR-132 使炎性因子表達水平降低，神經細胞死亡減少，緊密連接蛋白表達水平升高，神經功能得以改善。miR-27a-3p 則是通過直接調節AQP11 影響腦血管內皮細胞通透性。AQP11 是水通道蛋白家族的一員，盡管相較于表達豐度都較高的AQP4和AQP1，AQP11的表達豐度較低，但AQP11 可以同時調節水和糖在血液-腦組織中的轉運[26]。腦出血后miR-27a-3p 水平降低，導致AQP11 異常上調，從而影響血腦屏障正常通透轉運。

綜上所述，miRNA作為表觀基因修飾的重要組成部分，在腦卒中后血腦屏障損傷過程中起重要的調控作用，為治療干預提供了多重靶點[27]。采用具有較高載藥量、良好生物相容性、主動靶向性、低毒性的遞送方式，外源性補充保護性miRNA，可以保護血管內皮形態，減少緊密連接破壞，維持血腦屏障通透性及物質轉運，減少腦組織損傷體積，改善腦卒中后神經功能恢復[28]。因此，進一步探討如何安全、高效地外源性補充保護性miRNA、抑制損傷性miRNA有長遠的臨床意義。