硝酸鹽調控豆科植物與根瘤菌共生固氮的機制研究

羅振鵬 謝芳

（1. 中國科學院分子植物科學卓越創新中心 植物生理生態研究所 植物分子遺傳國家重點實驗室，上海 200032；2. 中國科學院大學，北京 100049）

氮是生命活動的必須元素，也是植物生長發育所需的大量營養元素。氮在自然界中主要以氮氣的形式存在，氮氣含量豐富卻不能被植物直接吸收利用，而是需要被固定還原為氨，才能進一步為生物所利用。生物固氮，特別是豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮，是自然界中固氮效率最高、也最具開發利用價值的體系。

豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮是一個非常復雜且精細調控的過程，需要共生雙方的“分子對話”和信號交流［1-2］。豆科植物通過與根瘤菌間的共生固氮作用獲取生長發育所需的氮素，在缺乏氮素的條件下生長。但共生固氮過程也是一個非常耗能的過程，需要消耗植物大量的生物能。為了平衡生長和固氮，豆科植物演化出一套有效的機制來形成“合適”的根瘤數目。目前的研究表明，豆科植物可以通過結瘤自主調控（Autoregulation of nodulation，AON）途徑抑制根瘤共生［3-4］。此外，當土壤中存在充足的氮素，豆科植物會選擇直接吸收外界環境中的氮而抑制共生固氮［5］。當土壤中存在高濃度的硝酸鹽時，共生過程會被抑制，表現為侵染線、根瘤數目顯著減少，根瘤形成小且沒有固氮能力的白色根瘤［6-8］。通過遺傳、嫁接及分根等實驗表明硝酸鹽抑制結瘤涉及局部和系統性信號［9-10］。NLPs（NIN-like proteins）轉錄因子在根部發揮功能，通過調控下游靶標基因的方式參與硝酸鹽抑制共生固氮過程［11］，而AON途徑被硝酸鹽信號激活后通過系統性調控的方式抑制根瘤的形成［8，12］。而本文將結合最近在模式植物百脈根（Lotus japonicus）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中的一些研究結果，討論NLPs轉錄因子、AON途徑如何協調參與硝酸鹽抑制豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮過程。

1 結瘤自主調控（AON）參與硝酸鹽抑制結瘤

豆科植物通過與根瘤菌共生互作的方式獲得了生長發育所需的氮素，但共生固氮也會消耗植物大量的碳源。為了平衡生長和固氮，豆科植物演化出一套系統性調控根瘤數目的負反饋調節信號途徑，稱為結瘤自主調控［3，13-14］。AON途徑相關的基因發生突變，植物根瘤數目會失去了控制，就會表現出超結瘤（Hypernodulation）的表型，導致過度固氮并消耗植物大量的光合產物，植物表現出生長矮小等表型［5，15-17］。AON途徑涉及植物地下和地上的長距離信號傳導。在百脈根的研究中發現，結瘤因子信號激活NIN（Nodule Inception）的表達，NIN作為轉錄因子激活CLE-RS1（CLE-Root Signal 1）和CLERS2的表達［18］。CLE-RS1/2短肽被剪切及加工后通過木質部從根部轉運至地上部，被地上部的類受體激 酶（Leucine-rich repeat（LRR）-type receptor-like kinase）HAR1（Hypernodulation Aberrant Root 1）所識別［5，19］，隨后激活 SDI（Shoot-Derived Inhibitor）信號從地上部轉移至根部抑制根瘤的形成［20］。Kelch-repeat的F-box蛋白TML（Too Much Love）位于HAR1的下游，在根部負調控根瘤的數目［20］。

AON途徑在豆科植物中十分保守，在蒺藜苜蓿、豌豆（Pisum sativum）、大豆（Glycine max）和菜豆（Phaseolus vulgaris）中均發現了HAR1的同源 基 因， 包 括MtSUNN（Super numeric nodules）、PsSYM29、GmNARK（Nodule autoregulation receptor kinase）和PvNARK［21-24］，這些基因突變后都表現出相似的超結瘤表型，以及受根瘤菌誘導的CLE短肽：MtCLE12、MtCLE13和 GmRIC1（Rhizobia induced CLE 1）、GmRIC2、PvRIC1 和 PvRIC2 等［24-27］。最近的研究表明，根瘤菌誘導豆科植物地上部miR2111的表達，隨后miR2111通過韌皮部從地上運輸到根部，與TML結合從而調控根瘤的形成［28］。

有意思的是，AON途徑中的突變體在根瘤數目上也表現出一定的硝酸鹽耐受性（Nitrate tolerance）［4］。通過在高硝酸鹽條件下篩選大豆突變體，得到了一批硝酸鹽不敏感的突變體nts（Nitrate tolerant symbiosis）。這些突變體在高硝酸鹽條件下依然具有超結瘤的表型［29］。通過對這些突變體的基因克隆發現，它們都是由類受體激酶GmNARK基因突變導致［23］。隨后在其它豆科植物中也發現了與AON途徑相關的突變體對硝酸鹽不敏感，在高硝酸鹽條件下依然表現出超結瘤表型。例如，百脈根中的har1、klv（klavier）、plenty，蒺藜苜蓿中的sunn、lss（like sunn supernodulator）、rdn1， 豌 豆 中的sym29等［5，15，17，21，30-32］。除此之外，一些 CLE短肽也受硝酸鹽誘導表達，如百脈根中的CLE-RS2和CLE-RS3［33］。遺傳和嫁接實驗表明，CLE-RS2過表達引起根瘤數目降低，且依賴于植物地上部受體HAR1［33］。而大豆中的NIC1（Nitrate induced CLE 1）同樣受硝酸鹽誘導，但NIC1在根部發揮功能，且依賴于植物地下部的受體NARK［25］。以上結果都表明AON途徑在硝酸鹽抑制結瘤中起著重要的作用。

高濃度的硝酸鹽除了抑制根瘤的形成，也會抑制根瘤發育以及固氮酶活性［8］。Cabeza等［34］發現蒺藜苜蓿的根瘤在處理硝酸鹽后，編碼豆血紅蛋白（Leghemoglobins）的相關基因顯著下調，固氮酶需要在低氧的環境才能維持活性，而豆血紅蛋白可以與氧氣結合，為固氮酶提供低氧的環境。這暗示著硝酸鹽抑制固氮酶活性可能是通過影響豆血紅蛋白的表達，導致根瘤內氧氣濃度過高，引起固氮酶的活性下降。除此之外，高濃度的硝酸鹽還會抑制侵染線的形成，影響侵染效率［6］。而AON途徑中的sunn、rdn1和har1等突變體雖然在高硝酸鹽條件下依然能形成過量的根瘤，但根瘤發育受到限制，只能形成大量小且沒有固氮能力的白色根瘤。這說明除了AON途徑外，還存在著其它途徑參與硝酸鹽抑制豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮過程。

2 NIN-like proteins（NLPs）轉錄因子介導硝酸鹽抑制結瘤

NIN是第一個被分離鑒定到的豆科植物基因，協同調控根瘤菌侵染和根瘤器官發育［35］。近些年在擬南芥及其它植物中的研究發現，NIN-like protein（NLPs）在硝酸鹽信號途徑中具有重要作用［36］。NLPs與 NIN 一 樣 C端 都 具 RWP-RK 和PB1結構域［37］。擬南芥基因組中存在9個NLP基因［37］。NLP7感受到硝酸鹽后，NLP7蛋白從細胞質中穿梭到細胞核，從而調控硝酸鹽信號相關基因的表達［38］。NLP7作為響應硝酸鹽信號的核心轉錄因子可以結合包括硝酸鹽吸收、代謝、信號轉導相關基因的啟動子上，激活這些基因的表達，從而向下傳遞硝酸鹽信號［38-39］。NLP8在感受硝酸鹽信號后，能夠直接激活ABA水解酶CYP707A2（cytochrome P450，family 707，subfamily A，polypeptide 2）的表達，從而降低ABA含量，打破種子休眠，該研究表明NLP8參與硝酸鹽調控種子萌發的過程。與NLP7不同的是，NLP8定位于細胞核，其定位不受硝酸鹽影響［40］。

最近，在蒺藜苜蓿和百脈根中分別發現NLPs轉錄因子在調控硝酸鹽抑制根瘤共生的過程中發揮著重要作用。Lin等［11］研究發現，蒺藜苜蓿中存在5個NLP基因，5個NLP均可以與NIN蛋白相互作用。他們對這5個NLP基因進行RNA干擾發現，除了NLP2外，其它4個NLP基因的下調，在結瘤上均表現出一定的硝酸鹽耐受性。隨后獲得的兩個NLP1 Tnt1插入突變體在氮素缺乏的條件下，形成與野生型一致的根瘤數目和可以正常固氮的根瘤。但在高濃度硝酸鹽存在的條件下，nlp1在根瘤數目、侵染線的形成以及固氮酶活性和野生型相比都有顯著的提高，說明NLP1在硝酸鹽抑制共生固氮的過程中發揮著重要的作用。進一步的研究發現，與擬南芥中的NLP7一樣，NLP1能夠響應硝酸鹽信號從細胞質進入到細胞核中。NLP1通過C端的PB1結構域與NIN互作，并能抑制NIN對下游靶標基因CRE1、NF-YA1的激活。該研究表明NLP1感受硝酸鹽信號之后，通過干擾NIN的功能從而抑制共生過程。然而，NLP結合的NRE（Nitrate response element）元件與NIN結合元件NBS序列較為相似，體外EMSA實驗表明NIN也可以直接結合到NRE上［41］。過表達NIN會抑制響應硝酸鹽信號基因的表達［42］，說明NIN和NLPs存在著相互競爭靶標基因的可能性。因此，NLP1抑制NIN對下游靶標基因的激活，是因為蛋白復合體的形成減弱了NIN對下游靶標基因的激活能力，還是二者競爭結合到NIN的靶標基因的啟動子區并減弱了NIN對靶標基因的激活能力，還有待于進一步研究。

此外，Nishida等［12］在百脈根中也發現了NRSYM1（LjNLP4）參與硝酸鹽抑制共生固氮過程。與蒺藜苜蓿nlp1突變體表型一樣，nrsym1（nitrate unresponsive symbiosis 1）突變體在根瘤數目，侵染線的形成以及固氮酶活性表現出很強的硝酸鹽耐受性。NRSYM1同樣能響應硝酸鹽入核，隨后結合在靶標基因啟動子區域的NRE元件上激活包括硝酸鹽信號NIA（Nitrate reductase）、NIR1（Nitrite reductase 1）以及與AON途徑相關的CLE-RS2基因的表達，然后通過HAR1介導的AON途徑系統性抑制根瘤形成。雖然Nishida等通過遺傳、生化和嫁接實驗證明了硝酸鹽能夠誘導NRSYM1入核，激活CLE-RS2的表達，隨后通過AON途徑抑制根瘤數目。但AON途徑只參與硝酸鹽抑制根瘤數目，不參與抑制其它共生過程［8，12］。而NRSYM1除了調控根瘤數目以外，還參與了硝酸鹽抑制結瘤的其它共生過程，包括侵染線的形成、根瘤發育及固氮酶活性。這說明除了AON途徑以外，NRSYM1還能通過其它途徑激活不同下游的靶標基因介導硝酸鹽抑制共生固氮過程。

3 CEP短肽在硝酸鹽抑制結瘤中的作用

除了AON途徑系統性負調控根瘤數目以外，近年來還在蒺藜苜蓿中發現CRA2（Compact Root Architecture 2）介導的正向調控結瘤途徑，CRA2也編碼一個富含亮氨酸重復的類受體激酶［43］。cra2突變體側根數量顯著增加，但根瘤數目顯著減少［43］。嫁接實驗發現地上部CRA2控制結瘤，而地下部CRA2控制側根的形成［43］。Mu 等［36］發現在蒺藜苜蓿中，CRA2與SUNN介導的AON途徑在調控根瘤數目方面相互獨立；cra2突變體在根瘤數目上表現出對硝酸鹽敏感，但cra2 sunn雙突變體在根瘤數目上表現出硝酸鹽耐受性。CRA2是擬南芥中CEP（C-terminally Encoded Peptide） 受 體CEPR1（CEP Receptor 1）和CEPR2在蒺藜苜蓿中的同源基因［44］。CEP被低氮誘導表達，隨后被剪切加工為成熟的短肽后，從根部轉運到地上部被受體CEPR1和CEPR2識別，激活地上部信號CEPD（Downstream of CEP）基因的表達，CEPD短肽通過韌皮部轉運至地下正向調控NRT2.1基因的表達，從而促進植物對硝酸鹽的吸收［44-45］。與擬南芥中一樣，蒺藜苜蓿中的CEP基因在低氮條件下被誘導表達。過表達CEP1基因或體外添加CEP1短肽都能增加根瘤數目及抑制側根的形成［46］，而在cra2突變體中則不能，說明CRA2極有可能是CEP的受體［46-47］。此外，過表達CEP1基因或體外添加CEP1短肽均能提高根瘤對硝酸鹽的耐受性，根瘤數目與對照相比有顯著的提高［46］，而且CEP1短肽提高蒺藜苜蓿根瘤對硝酸鹽的耐受性依賴于地上部的CRA2的存在（本實驗室未發表數據）。施加濃度梯度硝酸鹽實驗表明，cra2突變體對硝酸鹽更加敏感，在低濃度硝酸鹽處理下，根瘤數目顯著降低（本實驗室未發表數據）。這些研究結果表明CRA2所介導的正向調控結瘤途徑和CEP1都參與了硝酸鹽抑制結瘤的過程。察到，但其中的分子機制還不十分清楚。硝酸鹽信號組分NLPs廣泛參與了硝酸鹽抑制共生固氮過程，包括侵染線的形成、根瘤發育、根瘤數目及固氮酶活性。目前的研究結果表明，NLPs通過AON途徑系統性抑制根瘤數目，但NLPs是否與另一系統性途徑CRA2途徑存在著cross-talk目前還不清楚。嫁接結果表明NLPs在根部發揮作用，暗示著NLPs可能介導局部信號參與硝酸鹽抑制共生過程。NLPs雖然在硝酸鹽抑制根瘤共生中發揮重要作用，但其它硝酸鹽信號組分是否參與硝酸鹽抑制結瘤還需要進一步的探究。此外，植物激素乙烯也參與硝酸鹽抑制共生固氮的過程。乙烯負向調控共生過程，外部施加乙烯會抑制根瘤菌的侵染和結瘤［48］。乙烯信號途徑組分EIN2（Ethylene INsensitive 2）突變體Mtsickle具有超侵染和超結瘤的表型［49］。從紫花苜蓿（M.sativa）中的研究發現，硝酸鹽處理會增加植物根部乙烯的含量，而乙烯合成抑制劑AVG處理可以提高結瘤的硝酸鹽耐受性［50］。這些結果都說明乙烯在硝酸鹽抑制結瘤的過程中發揮作用。然而乙烯如何參與硝酸鹽抑制結瘤，以及與其它途徑是否存在著聯系還需要進一步的研究。

豆科作物可以通過共生固氮來滿足植物對氮的需求，因此在農業生產中可以減少對豆科作物氮肥的施用量。但由于片面追求作物產量而過度施加氮肥導致大量的氮素殘留在土壤中，抑制了豆科植物與根瘤菌間的共生固氮作用。了解硝酸鹽抑制豆科植物與根瘤菌共生固氮的機制可以避免施用過多的氮肥，同時也可以通過分子育種和基因工程手段提高豆科作物共生固氮的硝酸鹽耐受性，提高共生固氮效率以減少無機氮肥的使用，從而改善土壤環境。

4 總結及展望

高濃度的氮抑制根瘤的形成和固氮酶活性，這被稱為 “氮阻遏”現象。盡管這一現象很早就被觀