藻類光遺傳學的研究進展

任慶敏，王寅初

(中國科學院煙臺海岸帶研究所， 煙臺 264003)

藻類是光合自養的低等生物，能感知自然界中光質、光強和光照方向的變化。藻類通過復雜的光感知系統感知環境中光的變化，從而適應性地改變其生理和發育過程。藻類具有多種類型的光受體，使得它們能夠調節各種光依賴性的細胞和生理過程從而改變它們的行為。此外，波長或光譜組成的變化也能夠調節其發育和生理過程，例如晝夜節律。因此，對潛在的趨光和避光反應的機制以及其他光依賴性的過程的深入探索有助于藻類光生物學的發展。

經過一個多世紀的研究，已經基本了解藻類在生理、生物物理和形態學方面對光的響應過程。然而，直到21世紀初，隨著基因組和轉錄組測序技術的迅速發展，才發現光介導的行為反應中的關鍵蛋白。光敏感通道蛋白-1(Channelrhodopsin-1, ChR1)和光敏感通道蛋白-2(Channelrhodopsin-2,ChR2)，這兩種從萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中發現的視紫紅質光受體，參與了單細胞綠藻的光感知和光誘導運動[1-4]。經藍光照射后的光門控離子通道能夠使細胞去極化[1-2]。之后，新的光敏感通道蛋白的發現和新的修飾變體的設計促使該領域迅速擴大，為在時間和空間上精確地控制細胞信號傳導提供了一個良好的基礎。

光遺傳學領域的快速發展使光敏感結構域的需求日益增加，比如開發具有其他吸收光譜和新的光電性質的結構域，以應用于光遺傳學和合成生物學。目前這一領域最熱門的是光控酶，例如光激活的鳥苷酸或腺苷酸環化酶。這些酶可以以光依賴性方式改變信號分子cGMP或cAMP的水平。另一類有前景的具有酶活性的光感受器來源于組氨酸激酶視紫紅質的家族，其發現于團藻和衣藻。紫外/藍光敏感光感受器使光遺傳學不僅應用于神經科學，還能通過解鎖許多其他細胞過程和參數進行光遺傳學干預，包括基因表達、DNA重組、亞細胞定位、細胞骨架動力學、細胞內蛋白質穩定性、信號轉導級聯、細胞凋亡和酶活性[5]。新的光敏感工具的發現有力促進了光遺傳技術的發展，而藻類無疑是光敏蛋白的一個重要來源。

1 光敏感蛋白

光敏感蛋白是一類發現于單細胞微生物的視蛋白，可以感知不同波長的光的刺激，并對該光學刺激產生一系列反應。光敏感蛋白是膜整合蛋白(如光敏感通道蛋白)或細胞質的可溶性蛋白質(如光敏色素)，通常由蛋白質部分和非蛋白質光傳感器組成，其吸收光子并直接或間接產生生物效應。

光敏感蛋白可以分為3類：紅/遠紅光吸收的光敏感蛋白(例如光色素)，UV-A/藍光吸收的光敏感蛋白(如向光素和隱花色素)和UV-B-sensing(如UVR8)光敏感蛋白。這些光感受器已經被證實調控植物光形態發生期間的大量基因表達[5]。光受體介導多種方式的基因表達調控，包括轉錄、分化、翻譯和翻譯后，最終誘導適應性或發育性光形態反應。此外，最近的報告表明，組織或發育調節的光感受器或相關信號成分的表達以組織特異性方式觸發不同靶基因的轉錄水平的變化[6]。

自1971年細菌視紫紅質(Bacteriorhodopsin，BR)首次被報道后，各種特性不同、激活波長不同的光敏感蛋白也陸續被發現，如鹽視紫紅質(Halorhodopsin，HR)、通道視紫紅質(Channelrhodopsin，ChR)等，但在2005年Lopez-juez等[7]證明了綠藻來源的視蛋白可以使神經元對光產生應答后，光遺傳學才首次引起人們的普遍重視。

用于激活神經元的光敏感通道蛋白ChR2，最早從萊茵衣藻中發現，后經人為突變、修飾，改造成適用于哺乳動物細胞、表達穩定對細胞無毒的工具。該蛋白在藍光的激發下通道會快速打開，滲透吸收一價和二價陽離子，但是其對不同陽離子的通透性并不相同，ChR2對Ca2+的通透性最大，形成光電流的主要離子為Ca2+[2]。

光遺傳學中也使用了其他一些來自于藻類的光敏感蛋白，包含CyChR1、CraChR2、MChR1、DChR以及VChR1等。Banghart等人在隱芽藻類中發現了天然存在的陰離子轉運通道：陰離子通道視紫紅質(Anion Channel Rhodopsins, ACRs)[8]，ACRs能夠嚴格地傳導陰離子，完全阻止質子及更大的陽離子通過，所以能實現快速超極化，因此它擁有前所未有的光敏感度和時間精度。第一種定位于真核細胞的質膜的藻類離子泵視紫紅質發現于南極藻Coccomyxasubellipsoidea中，其僅通過光照可以復原(沉默)神經元活動[9]。

光敏感蛋白不僅能興奮靶細胞，另外還有對其具有抑制作用的光敏感通道蛋白，常用的抑制性光敏感蛋白有鹽視紫紅質(HaloR、NpHR)和古紫紅質(Archaerhodopsin-T，ArchT)[9]。如NpHR，為氯離子轉運視紫紅質蛋白，來源于嗜鹽堿單孢菌，可被黃光激活，泵入氯離子使細胞膜超極化從而抑制其興奮性[10]。

2 藻類光受體在體內的功能

藻類具有高度復雜和多樣化的隱花色素光受體，藻類光受體包括最初在高等植物中發現的經典光感受器(即向光素、細胞色素、光敏色素和UV-B光受體)，用作光門控離子通道的視紫質樣光受體，以及其他光受體家族。

藻類必須根據光來優化它們的光合活性以實現光合作用高效化，許多細胞生理過程包括性發育、晝夜節律、氮和脂質代謝、細胞周期和細胞分化都由光調節[11-12]。

向光素的光感受器是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由藍光激活，藍光可以誘導藍藻細胞分裂的延遲[13]，并參與控制衣藻的性發育和細胞大小過程。由于衣藻中的向光素的非光化學淬滅(NPQ)過程，光感受器、光合作用和光保護作用之間存在分子聯系，而且除了光，下游代謝也會影響這種適應過程[14]。向光素的感光細胞也參與藍光介導的轉錄物的積累變化，這是負責葉綠素和類胡蘿卜素生物合成的酶產生的[15]。在多細胞藻團藻中，向光素的轉錄在小的深綠色的生殖細胞中比在大的中更易表達。

藻類隱花色素家族一般是藍光受體，它們參與晝夜節律的調節以及DNA修復。在衣藻中，隱花色素參與調節各種途徑的基因的轉錄水平，這些基因以各種方式響應藍光和紅光[16]。植物隱花色素和CPF1是UVA/藍光受體，而動物樣隱花色素幾乎可以響應整個可見光譜，包括紅光。因此，根據植物隱花色素、動物樣隱花色素和CPF1的可見光和紅外光譜特征能夠揭示對光的結構響應[17]。

在團藻中，這種感光器在生殖細胞中高度表達，并表現出較高的光合活性。光敏感通道蛋白，屬于I型視紫紅質，參與衣藻的趨光性或避光反應[3, 18]。VChR1被假定為營養條件下趨光性的主要光受體[19]。另外4種視紫紅質樣光受體，被稱為組氨酸激酶視紫紅質，已在團藻和衣藻基因組中被鑒定。這些光受體響應光刺激或其他環境刺激(如溫度)可以改變cAMP或cGMP的濃度。cAMP被假定為團藻細胞內的第二信使，能針對誘導物的存在而觸發信號級聯反應，導致性發育。但cAMP在團藻中是否參與性分化是有爭議的。cAMP(或cGMP)不僅激活交配反應也能激活所有必要的反應。cAMP介導的蛋白激酶級聯反應和cAMP控制的離子通道都與衣藻的cAMP信號轉導相關[20]。在團藻中，丁酰cAMP增加之后雄配子體就解體了[21]。因此，對組氨酸激酶視紫紅質的有關性分化功能的研究具有一定的意義。

團藻生活的自然環境中夏季溫度的升高會作為一種環境刺激使其從無性到有性發展。保守視紫紅質域的組氨酸激酶視紫質可以檢測某些波長之間光屬性的變化，導致那些進行無性生殖的單倍體物種中二倍體受精卵的基因重組。這可能是由于反應調節器可激活響應域的鳥苷酸和腺苷酸環化酶然后產生cGMP/cAMP。在團藻中，性發育不僅發生在溫度增加時，還發生在抗氧化反應中。cAMP/cGMP觸發的轉錄因子可能參與生長過程中細胞特異性基因表達的調控[23]。此外，在衣藻中cAMP依賴的蛋白激酶級聯反應被認為參與cAMP信號轉導， Nedelcu等人發現cAMP水平增加可能是由于視紫紅質的激活引起的[24]。

3 藻類光遺傳學的應用

光敏感通道蛋白的細胞類型特異性啟動子可以激活空間和時間分辨率極高的特定類型的神經元。大多數實驗室目前使用的是來自衣藻的野生型光敏感通道蛋白-2，其吸收的藍色光峰值約為470 nm，但越來越多的證據表明來自其他藻類的光敏感通道蛋白(如來自團藻的光敏感通道蛋白)也在神經生物學中有巨大的應用潛力。如團藻光敏感通道蛋白-1在大約520 nm的峰處紅移，因為紅光比藍光危害小，因此，它似乎更適宜應用于動物和人類模型。在過去幾年中，根據團藻和衣藻中已公開的光敏通道蛋白序列的相似性，在各種藻類物種中鑒定出了幾種其他的光敏感通道蛋白。在鞭毛藻Mesostigmaviride中發現了一種紅移的光敏感通道蛋白，MChR1，其在520 nm(在中性pH值下)有峰值[25]。在海藻Platymonassubcordiformis中，鑒別出一種峰值在437 nm(在中性pH值)的高效藍移光敏感通道蛋白[26]。它們在光遺傳學中都有很大發展潛力。

此外，衣藻光敏感通道蛋白-1和團藻光敏感通道蛋白-1的嵌合體被用于生成新的高效色彩調節光敏感通道蛋白。這些嵌合的光敏感通道蛋白具有較大的光電流，最大吸收波長范圍為526 nm到545 nm[27]。

另一種類型的藻類視紫紅質樣感光器——組氨酸激酶的視紫紅質家族，可用于控制光遺傳學應用中的細胞過程。這些光控酶可以根據光來改變信號分子的水平，例如cAMP。因此，它們也適合作為利用外部光刺激來操縱動物行為的光遺傳學工具。但是由于這些光感受器中的大的蛋白質由4個亞基組成，使其在宿主細胞中表達及純化復雜。此外，組氨酸激酶視紫紅質的功能還包括吸收光譜、光電流性質、酶活性和生物功能。

一些最近的研究表明，光敏感蛋白也可以用來控制蛋白質之間的相互作用，例如植物光敏色素，已經成功地用于控制紅色和遠紅光下的基因表達[28]。利用藍光誘導系統，實現了萊茵衣藻中靶基因表達的光遺傳學調控從而可以誘導產氫[29]。

隱花色素和與之相互作用的CIBI也是用藍光控制基因表達的藍光受體，它們被用于開發了具有光誘導轉錄效應子(LITE)的光遺傳學雙雜交系統。這種LITE系統可用于基因轉錄的可逆激活[29]。

4 展望

以基因工程的方法將光敏感通道蛋白轉入神經細胞，使神經細胞經藍光照射而興奮，經黃光照射則抑制，此光感基因調控技術利用不同波長的光可實現活體水平神經細胞精確調控[30]。

隨著多種特性不同、被激活波長不同的光敏感蛋白的陸續發現與豐富，采用光照以精準控制并調控細胞的光遺傳學技術也得到了迅速發展。光遺傳學最初被用作神經元的前體，現在該技術可用于操縱多種系統，例如心房心肌細胞、胰島細胞和腫瘤細胞，在多種細胞和多種疾病的研究與治療中表現出極大的潛力[31]。

在未來，重點可以放在新的光受體的深入研究上，包括它們的精確的(酶)活性、吸收性能、光電性能和蛋白質結構分析。如果能夠在藻類中發現新的光受體，那將對之后的深入研究帶來巨大的影響。這對于揭示某些分子作用機制十分有益，甚至可以用作光敏蛋白基于結構的工程基礎。我們還需要鑒定光受體中的相互作用對，這不僅有利于進一步了解光受體信號網而且對合成生物學和光遺傳學的進展是非常重要的。