腸道病毒組與人體健康研究進展

陶萬銀, 朱 書

(中國科學技術大學 生命科學與醫學部 中科院天然免疫與慢性疾病重點實驗室合肥微尺度物質科學國家研究中心分子醫學部， 合肥 230026 )

腸道微生物對疾病和健康的影響越來越受到人們的重視。腸道中生活著包括原核生物細菌、古細菌、真核生物真菌、原生動物以及無細胞結構的病毒等多種微生物。當前對腸道微生物的研究以腸道細菌為主，人們已經認識到包括多種自身免疫性疾病、代謝性疾病、神經系統疾病、腫瘤等多種疾病的發生、發展和治療都與腸道菌群有關[1]。病毒是指沒有細胞結構，依賴宿主細胞完成復制的一類生物。起先病毒是作為“致病因子”被發現的，也是導致許多重要人類疾病的病原體，如人類天花、流感、艾滋病及病毒性肝炎等多種傳染病的致病原都是病毒。近年來隨著深度測序技術的發展，人們認識到在健康人體中也存在大量的病毒。根據宿主不同，腸道病毒組包括真核DNA和RNA病毒，原核生物(包括細菌和古細菌)噬菌體，人類基因組中的內源性逆轉錄病毒元件(Endogenous retrovirus elements)等[2-3]。腸道病毒與人體免疫及疾病的關系也越來越受到重視，已經報道了包括炎性腸炎、腸癌、腸道感染等多種疾病的發生與腸道病毒相關[2-3]。

1 腸道病毒組的演化和穩態

腸道病毒包括內源性逆轉錄病毒元件；感染人類、腸道中的小型真核細胞，或者是作為食物來源的動物，植物的真核病毒；以及感染細菌的病毒，即噬菌體。根據形態觀察正常糞便包含病毒樣顆粒約108～109/g，其中絕大多數是噬菌體[4]。在出生后的最初幾年中，由噬菌體和真核生物RNA和DNA病毒組成的病毒微生物組處于快速演化的狀態，而成年后整體上是相對穩定的[5-6]。關于人類在胎盤中是否會接觸到微生物還有爭議，一般認為排除感染因素正常胎盤中不含有可檢測到的微生物，腸道細菌是在出生后迅速獲得[7]。Lim等研究了健康嬰兒雙胞胎的縱向隊列中腸道病毒組和細菌微生物組，發現病毒組和細菌微生物組在同卵雙胞胎之間比在不相關的嬰兒之間更相似。從出生到2歲階段，腸道真核病毒組和細菌微生物組擴大，相反，噬菌體病毒體組減少。噬菌體-細菌的關系呈動態變化，符合lotka-volterra捕食模型[8-9]。這一研究展示了嬰兒微生物群具有高度的動態性，并且細菌、病毒和噬菌體的組成與年齡的變化有關[5]。

在成人中觀察到微生物組相對穩定，并且宏基因組分析顯示每個人的微生物組成都是獨特的。Minot等通過宏基因組測序分析了一個成年個體超過2.5 年的病毒群落。在整個2.5年的研究期間腸道病毒組有80%持續存在，表明其長期的總體穩定性，而基因組的變異速率因病毒類型而異[6]。溫和噬菌體(Temperate phages)的突變率相對較低，這與其在整合原噬菌體狀態中通過細菌DNA聚合酶的精確復制有關。相反，單鏈環狀DNA基因組的裂解性噬菌體Microviridae顯示出高變異率(每天每個核苷酸 >10-5)，因此在該研究的2.5年期間累積的序列差異足以產生新的病毒株。由此可見，人類腸道病毒的多樣性源于兩個來源，即一小部分病毒在腸道內相對穩定存在，而另一部分來源于病毒的長期迅速進化[6]。

在宿主免疫狀態發生變化時，會引發腸道病毒組也發生變化。一些病毒呈潛伏狀態，在特定情況下會被重新激活。Reese等發現蠕蟲感染小鼠后，會誘導產生白細胞介素-4(IL-4)和轉錄因子Stat6的激活，在體內重新激活鼠γ皰疹病毒(γ-herpesvirus)感染。IL-4通過誘導Stat6與重要的病毒轉錄激活因子的啟動子結合，促進病毒復制并阻斷宿主干擾素-γ(IFNγ)的抗病毒作用，表明處于潛伏狀態的病毒已進化出了感知宿主免疫狀態的機制[10]。類似的，蠕蟲感染也會增強宿主對諾如病毒的易感性[11]。HIV感染后降低CD4+T細胞數量，削弱了機體免疫力[12]。Monaco等人對烏干達HIV感染患者的腸道病毒組和細菌微生物組進行了表征，分析比較了健康對照組，未治療的HIV感染患者以及用抗逆轉錄病毒療法(ART)治療的HIV患者等人群的腸道病毒組和細菌微生物組，發現外周CD4+T細胞數量降低與腸道腺病毒擴增相關，并且這種增加與是否接受ART治療無關。此外，CD4+T細胞數量較低的患者的腸道細菌多樣性和豐富性降低，而一些特定的細菌豐度也發生變化，比如與炎癥相關的腸桿菌科細菌的增加。因此，進行性HIV感染的免疫缺陷與腸道病毒組和細菌微生物組的改變有關，這一研究可能有助于認識和治療AIDS相關的腸道疾病[13]。

2 病毒組介導腸道中的“跨界”相互作用

腸道病毒與腸道細菌、腸道中的真核生物和宿主細胞相互作用。這些復雜的原核生物和真核生物的“跨界”相互作用對人體的健康和疾病有著重要影響[14]。腸道病毒組包含能夠感染各種真核或原核宿主的多種病毒，對介導“跨界”相互作用有著重要影響。真核病毒能夠直接影響宿主免疫系統，導致一些看似無害的病毒也可能引起疾病。呼腸孤病毒(Reovirus)經常感染人和小鼠，盡管感染后沒有明顯癥狀，但會破壞宿主對食物抗原的耐受，導致乳糜瀉(Celiac disease，CeD)。這是由于呼腸孤病毒感染抑制外周調節性T細胞(pTreg)轉化，并且促進TH1細胞對膳食抗原的免疫應答，打破了腸道對食物抗原耐受，從而引發乳糜瀉的發展[15]。

噬菌體能夠增強細菌毒力，間接影響人體健康。伴隨著細菌感染，噬菌體也大量出現在細菌感染部位。Sweere等分析了銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和它產生的絲狀噬菌體Pf對細菌感染的影響，發現Pf噬菌體促進了銅綠假單胞菌在人的傷口感染。在小鼠模型中，當Pf噬菌體存在時，銅綠假單胞菌的在傷口的感染能力提高了50倍[16]。Pf噬菌體是單鏈DNA病毒，小鼠或人白細胞內吞后產生Pf噬菌體RNA，并觸發TLR3-TRIF信號通路誘導I型干擾素IFNβ的產生，抑制腫瘤壞死因子(TNF)通路和宿主免疫細胞的吞噬作用。相應地，針對Pf的疫苗免疫后可防止小鼠銅綠假單胞菌傷口感染，表明針對病原相關噬菌體的疫苗接種也可能作為預防細菌感染的潛在策略[16]。

噬菌體也能夠激活宿主腸道免疫信號通路。對在CD和UC患者的腸道病毒組深入分析顯示，CD和UC與有尾目噬菌體(Caudovirales)的顯著擴增有關，并且腸道病毒體的擴增和多樣化可能并非是細菌群體的變化結果，而是導致其發生變化的原因[17]。Duerkop等從患有IBD的人類患者中分離出4株Caudovirales噬菌體用于抑制大腸桿菌的生長以治療腸道腫瘤，在結直腸癌的小鼠模型中能夠有效抑制腸腫瘤生長，顯示出了很好的效果。分析顯示，這些噬菌體通過TLR9依賴的干擾素應答通路激活腸道的免疫反應，引起小腸組織中幾種促炎基因上調，也促進了腸道派氏結(Peyer′s patches)中CD4+和CD8+T細胞群的擴增。用純化的噬菌體處理葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate，DSS)誘導的結腸炎模型小鼠，會加重炎性腸炎癥狀[18]。這一發現給出了腸道噬菌體影響宿主免疫的直接證據。

病毒有可能會編碼調控宿主代謝等功能的多肽，調節宿主功能。 Altindis等通過搜索美國國家生物技術信息中心(NCBI)的病毒/類病毒基因組數據庫，在病毒基因組中尋找和62種人體肽激素、代謝相關細胞因子或生長因子等具有同源性的肽序列的存在。結果發現病毒攜帶與幾種人類肽激素具有顯著同源性的序列，包括胰島素，胰島素樣生長因子(IGF)-1和-2，成纖維細胞生長因子(FGF)-19和-21，內皮素-1(endothelin-1)，抑制素(inhibin)，脂聯素(adiponectin)和抵抗素(resistin)等。人工合成的病毒類胰島素樣多肽(VILP)能夠與人或小鼠胰島素受體或IGF1受體結合，刺激受體介導的信號傳導，增加葡萄糖攝取，并激活細胞增殖。向小鼠靜脈注射VILP可顯著降低血糖，表明其在體內有活性[19]。

3 腸道病毒組與結直腸癌

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)的發病與腸道微生物有關，結直腸癌患者與健康個體的腸道微生物組不同，包括腸道菌群[20]、腸道真菌[21]和腸道病毒等[22-23]。與健康對照組相比，結直腸癌患者腸道噬菌體群落的多樣性顯著增加。進一步臨床亞組分析表明，腸道病毒組的失調與結直腸癌的進程有關，有20種以上的病毒屬在患有結直腸癌的受試者和健康對照者之間有區別[22]。Hannigan等在結直腸癌患者糞便樣本中鑒定出組成發生改變的病毒，主要是來自Siphoviridae和Myoviridae家族的噬菌體[23]。已經有多項研究報道了腸道細菌促進結直腸癌的發展[24-25]，有可能腸道病毒組通過改變宿主細菌來間接影響癌癥進展[23]。至于腸道病毒是否以及如何直接影響結直腸癌的進展還有待進一步深入研究。

4 腸道病毒組與糞菌移植

通過糞菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)的方法恢復腸道穩態已經開展了大量臨床實驗，對多種疾病顯示出了不錯的效果[26]。在評估糞菌移植的治療效果和安全性時也需要重視腸道病毒在其中可能發揮的作用。一般認為FMT的治療效果主要是恢復腸道菌群的多樣性和穩態來達到治療效果。考慮到腸道病毒組和菌群的相互作用及其對宿主的影響，腸道病毒組可能對糞菌移植的預后也會有影響。耐藥性艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)在采用FMT治療后治愈率達到85%～90%[27-28]。通過對CDI患者腸道病毒組測序分析，Zuo等發現CDI感染患者腸道病毒組多樣性也發生了顯著變化。與健康對照組相比，CDI的受試者表現出明顯較高的有尾噬菌體(Caudovirales)豐度和較低的有尾噬菌體多樣性和均勻性。糞菌移植治療導致CDI中有尾噬菌體的數量顯著減少。臨床觀察發現，移植后供者來源的有尾噬菌體占受者腸道病毒組的比例與治療效果呈正相關，提示在CDI糞菌移植治療中腸道有尾噬菌體可能發揮了作用[29]。而噬菌體能夠增強細菌感染毒力的發現也為糞菌移植的臨床安全性提出了警示[16]，即需要評估可能由腸道病毒引發的安全隱患。

5 展望

盡管腸道病毒組的重要性受到越來越多的重視，但目前的研究還很不充分，尚有大量科學問題亟待解決。

首先，需要加強腸道病毒組與疾病的相關性研究，更充分地認識腸道病毒組的動態變化。回顧過去十多年在腸道微生物研究中取得的成績，可以看到以16S rDNA深度測序為代表的技術進步，能夠不依賴體外培養快速低成本地鑒定腸道菌群的組成，極大地促進了細菌微生物組研究的快速發展[30]。而全面鑒定腸道中病毒的研究目前還存在許多困難，一是病毒的多樣性和序列高度變異性；二是病毒核酸所占比例較小，在純化和擴增病毒相關序列時很容易引入額外偏差；三是目前的建庫和測序方法在檢測RNA病毒方面尤其不足，而RNA病毒對人體健康有重要影響[31]。此外，測序得到的有可能是全新的病毒，其序列無法和數據庫中的已知病毒匹配[32]，因此病毒數據庫建設也需要加強，匯總收錄更多的病毒序列信息。不斷改進的建庫、測序、分析方法和病毒數據庫將有助于我們更好地認識腸道病毒在其他疾病中可能發揮的作用。

其次，需要加強對腸道病毒組的功能研究。腸道細菌的分離培養技術已經取得了長足的進步，據估計人類腸道中超過70%的細菌可以通過不同條件的培養基分離培養，為進一步研究腸道微生物功能奠定了基礎[33-35]。目前可以針對某一類宿主篩選病毒，比如針對艱難梭菌感染篩選得到的裂解性噬菌體有望用于耐藥菌的治療[36]。不過考慮到病毒感染的宿主特異性，大規模培養病毒更加困難，目前還沒有對病毒進行大規模培養的報道。Yang等利用利巴韋林等廣譜抗病毒成分(Anti-virus component，AVC)清除腸道病毒，研究干擾腸道病毒后對宿主的影響[37]。不過這種方法缺少特異性，不足以確定具體是哪種病毒發揮了作用。值得注意的是，目前研究中廣泛使用的SPF小鼠缺少自然環境下的共生的腸道菌群和腸道病毒，導致SPF小鼠有著與自然狀態下不同的免疫反應[38]。今后的研究中應當充分考慮不同腸道菌群和腸道病毒對宿主的影響。

隨著大規模測序數據的大量積累，通過生物信息學方法從數據庫中挖掘新病毒信息，并且尋找特定功能基因的策略將發揮重要作用。隨著已經解析結構的蛋白數量不斷積累，通過人工智能方法根據氨基酸序列來預測蛋白結構的準確率不斷提高[39]，使得根據蛋白相似性預測病毒-宿主間的相互作用關系成為可能。Lasso等開發了一個計算框架，基于結構的相似性來預測病原體-宿主相互作用(P-HIPSTer)，根據結構信息預測2.82萬例病毒蛋白和人類蛋白相互作用，通過實驗驗證率為76%，顯示了很高的準確率[40]。這一方法也有一系列新的發現，比如通過預測蛋白-蛋白相互作用來區分具有高或低致癌潛力的人乳頭瘤病毒(HPV)[40]，也為研究難以培養的病毒功能提供了思路。

在現代分子生物學發展的早期階段，許多重大發現都是基于噬菌體研究獲得的。病毒學研究還發展出許多強有力的研究工具，大大推動了生物學的研究發展。比如2018年諾貝爾化學獎一半授予了美國科學家G.P.Smith和英國科學家G.P.Winter爵士，以表彰其“用于肽和抗體的噬菌體展示”。作為細菌抗病毒免疫反應的CRISPR-Cas9系統，為基因操作提供了強有力的工具[41]。對腸道病毒組的進一步深入研究，或許也能給我們帶來意想不到的驚喜。