TGF-β1與自噬基因Beclin1、LC3在椎間盤退變組織中的表達*

蘇程果， 趙小艷，劉華輝，盧群文，袁 曄，羅才貴，朱明雙△

1.成都中醫藥大學附屬醫院(成都 610075)；2.四川寶石花醫院 (成都 610213)

椎間盤退變是腰腿痛的重要誘因，而腰腿痛嚴重影響患者的生活質量，也為患者、患者家庭、社會帶來嚴重的負擔。目前椎間盤退變的機制和治療方法仍需進一步研究。相關研究[1]表明，炎性反應、細胞外基質的分解、纖維環的破裂、椎間盤細胞的死亡等在椎間盤的退行性變過程中起關鍵作用。其中椎間盤髓核細胞數量的減少是椎間盤退變的關鍵因素，而細胞自噬對髓核細胞死亡有著重要的調控作用[2-3]，Beclin1與LC3均為自噬相關基因，參與自噬體的形成[4]。TGF-β1為轉化生長因子, 可調節細胞的生長和分化，與椎間盤退變關系密切。本研究主要觀察兔椎間盤退變組織中TGF-β1與Beclin1、LC3的表達，亦進一步探討椎間盤退變的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為4月齡新西蘭大白兔20只，體重為2.0～2.5 kg，購買于成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號為: SCXK(川) 2018-17，研究符合動物實驗倫理許可。

1.2 主要實驗試劑

RNA提取液(武漢Servicebio),三氯甲烷(上海國藥集團)；無水乙醇(上海國藥集團)；HyPure TMMolecular Biology Grade Water(美國HyClone) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo)FastStart Universal SYBR Green Master(美國Roche)引物(成都生工)；新型脫鈣液(北京索萊寶)；氫氧化鈉(上海滬試)。

1.3 主要實驗器械

臺式高速冷凍離心機(DragonLab)；熒光定量PCR儀(ABI)；超微量分光光度計(Thermo)；標準試劑型純水儀(青島富勒姆)；勻漿儀(AKI生物)；超低溫冰箱(海爾)；TIP頭(Axygen Biosciences)；脫水機 (武漢俊杰電子有限公司) ；包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；凍臺(武漢俊杰電子有限公司)；攪拌(DRAGONLAB)；恒溫搖床(BLabotery)；電子秤(Electronic)；18 G穿刺針。

1.4 方法

1.4.1 造模 借鑒黃杰烽等[5]的穿刺纖維環法制作椎間盤退變模型。20只白兔隨機分成兩組，空白組和模型組，每組10只。兔腰椎節段共7節，L1至L7的椎體和其間的椎間盤漸漸變大，腰椎的橫突與脊柱成銳角，向白兔頭側發出，且橫突長度從L1至L7漸漸增大；兔腰椎間盤位于橫突起點前上方2.0～3.0 mm處[6]，呈乳白色。模型組按3 mL/kg耳緣靜脈注射10%水合氯醛麻醉，俯臥位固定好，備皮消毒，髂棘高點平對 L6椎體，用筆依次標記各段腰椎。然后觸摸L5、L6的橫突，左手拇指定位在兩橫突末端連線中點，右手持針在定位點上方約1 cm處與地面水平破皮，然后針向頭側略傾斜即刺入 L4-5椎間盤，此時針下會有滯澀沉緊感。再穿刺L3-4、L5-6椎間盤，左右各1次。術后連續 3 d肌注青霉素40萬U/只。空白組不予特殊處理。

1.4.2 標本采集 6周后截取白兔第L3至L6腰椎及其間的椎間盤組織，每組隨機選6個椎間盤放入-80°冰箱保存；另外每組隨機選8個椎間盤放入體積分數4%甲醛溶液中固定24 h，預備做石蠟切片。

1.4.3 觀察與檢測 1)蘇木精-伊紅(HE)染色檢測椎間盤組織形態學變化。標本24 h固定后，用新型脫鈣液脫鈣2個月，脫鈣液更換周期為2～3 d。然后依次梯度酒精進行脫水，75%酒精2 h，85%酒精2 h，90%酒精1.5 h，95%酒精2 h ,無水乙醇Ⅰ 2 h，無水乙醇Ⅱ 2 h，醇苯40 min，二甲苯Ⅰ 40 min，二甲苯Ⅱ 40 min，65°融化石蠟Ⅰ 0.5 h，65°融化石蠟Ⅱ 1 h，65°融化石蠟Ⅲ 2.75 h。再進行石蠟包埋、以4 μm厚度切片，切片在攤片機40 ℃ 溫水上將組織展平，載玻片將組織撈起，60 ℃ 烘箱內烤干。水烤干蠟烤化后取出常溫保存備用。然后在光鏡下觀察椎間盤組織形態學變化，根據Han等[7-8]從髓核形態、髓核中細胞和基質形態、纖維環形態、纖維環中細胞的基質形態、纖維環和髓核的分界來評價椎間盤退變程度，分值5～15分，5分為正常椎間盤，15分為嚴重退變椎間盤。2 )RT-PCR檢測TGF-β1與beclin1、LC3的表達。先抽提總RNA，取100 mg組織加入到含有1 mL，離心的Trizol Reagent勻漿管中充分研磨，以轉速12 000 r/min，離心半徑5.5 cm，離心10 min，取上清；加入250 μL三氯甲烷后離心取上清，加入0.8倍體積的異丙醇離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA；加入15 μL無RNA酶的水溶解RNA，55 ℃孵育5 min；使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度。取2 μg RNA按照試劑盒操作進行反轉錄和定量PCR，結果處理采用ΔΔCT法計算TGF-β1與beclin1、LC3的表達量。引物序列如下表(表1)。

表1 引物序列

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組椎間盤組織形態學評分

空白組椎間盤組織的軟骨樣基質中分布著形態一致的髓核細胞，細胞間質排列均勻，髓核與纖維環分界清晰，纖維環結構完整，排列清晰。模型組髓核細胞大量減少，髓核形狀不規則，間質排列紊亂，局部纖維環結構紊亂；纖維環和髓核界限多不清晰。空白組和模型組組織形態學評分分別為(5.25±0.46)、(10.25±1.75)分，模型組高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明穿刺纖維環法促進了椎間盤的退變(圖1)。

圖1 HE染色結果

注： A:髓核細胞較少，髓核與纖維環界限不清(黑色箭頭)，纖維環內層可見少量嗜酸性小碎片(紅色箭頭)；B：髓核內纖維結締組織輕度增多(黃色箭頭)。C、D：空白組大小形態相似的的圓形髓核細胞，細胞間質均勻一致，髓核與纖維環分界清晰，纖維環結構完整，排列清晰

2.2 椎間盤組織中TGF-β1、Beclin1、LC3的mRNA表達

RT-PCR結果顯示，實驗6周后，相對于空白組，模型組TGF-β1、Beclin1、LC3的mRNA表達量升高，差異有統計學意義(P<0.01)(表2)。

組別TGF-β1Beclin1CL3空白組1.78±0.471.03±0.411.70±1.44模型組26.22±10.7913.53±3.2116.86±8.26t5.549.454.43P<0.001<0.0010.006

3 討論

TGF-β是一種具有多種生物功能的蛋白多肽細胞因子,由正常組織細胞及轉化細胞產生,且TGF-β1有廣泛的生物學作用，可調節多種細胞的活力與程序性細胞死亡[9]。TGF-β1具有促進椎間盤間充質細胞增殖和分化的作用,對機體脊柱中椎間盤的生長、發育及分化方面起重要作用。椎間盤退變與TGF-β1的表達有密切聯系。Tolonen等[10]通過ELISA及PT-PCR實驗證明了，TGF-β1可在椎間盤退變細胞高度表達,且TGF-β1與椎間盤退變程度呈顯著正相關[11]。而椎間盤細胞的自噬和程序性細胞死亡與椎間盤的退變過程緊密關系,TGF-β1 作為調控脊柱發育及穩態維持的重要因子，可能參與椎間盤的自噬及退變過程[8]。

自噬目前被認為是與年齡有關的疾病或變性疾病的重要保護機制，是一種細胞分解代謝途徑，導致溶酶體降解以及蛋白質和細胞器的再循環[12]。而LC3和Beclin 1為自噬小體標志物，常用以評價細胞自噬的程度[13]。LC3分Ⅰ型和Ⅱ型，當自噬發生，Ⅰ型 LC3經泛素樣加工修飾過程與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合， 變成Ⅱ型 LC3，Ⅱ型 LC3蛋白結合并始終位于胞內自噬體的膜上，其含量與自噬泡數目呈正相關[4]。Beclin1為哺乳動物酵母Atg6基因的同源物，其通過與Ⅲ 型磷脂酰肌醇激形成復合物參與募集其他蛋白質，促進自噬體膜的形成，并引導其他Atg蛋白定位于自噬體膜[14]。LC3、Beclin1的表達可明確細胞內自噬水平。有研究[15]發現，自噬的活性隨年齡和早期變性而降低。但也有相互矛盾的結果，非退行性成年大鼠的髓核細胞中可觀察到低水平的自噬[16]，而退行性大鼠髓核細胞中自噬水平顯著增加[2]。幾種可能的原因可解釋自噬活性的組織差異。首先，實驗椎間盤可能處于椎間盤退變過程的不同時期；再者，可能與干預措施有關，且自噬和程序性細胞死亡可并存[12]。

本研究HE染色結果顯示，模型組的椎間盤組織形態發生一定的變化，表明穿刺纖維環促進了椎間盤的退變。RT-PCR結果表明，模型組椎間盤中TGF-β1、Beclin1、LC3的mRNA相對表達量均顯著升高。正常椎間盤中TGF-β1的低含量表明，TGF-β1對正常的椎間盤有調節作用，而退變椎間盤中髓核細胞的改變可能刺激TGF-β1高表達，TGF-β1的增高可能與調節細胞活力、調節細胞外基質代謝和細胞自噬等相關。空白組中的椎間盤中有低水平自噬，亦表現了自噬在正常椎間盤髓核細胞中的生物學作用，而模型組椎間盤中退變椎間盤自噬基因Beclin1、LC3表達量均顯著增高。而自噬作為Ⅱ型程序性細胞死亡發生在組織和器官的發育過程中，自噬既能發揮保護作用，也能促進細胞死亡，細胞自噬亦有助于防止髓核細胞退變[17]。

綜上所述，本研究模型組退變椎間盤中TGF-β1、細胞自噬的表達增加，推測是對白兔退變椎間盤的一種調節機制。此次實驗結果有助于進一步了解椎間盤退變的機制，TGF-β1與自噬基因Beclin1、LC3相互關系還需進一步研究。