小檗胺聯合熱療對人胃癌順鉑耐藥細胞增殖的影響*

陳 妮, 趙 梅, 陳 玲, 韓鵬定

1.海南醫學院第二附屬醫院 藥學部 (海南 570311)；2.海南省第三人民醫院 藥學部(海南 572000)

胃癌是中國發病率較高的胃腸道惡性腫瘤[1]。盡管胃癌已經獲得了有效的治療方法，包括胃鏡檢查、全身化療和靶向藥物治療、手術切除等，但胃癌的預后仍然較差，數據[2]統計，胃癌患者的5年總生存率低于30%。小檗胺是來自小檗屬與黃連屬植物中的一種天然化合物，研究[3-7]發現，小檗胺對多種不同的癌癥有明顯的抗腫瘤作用。熱療是將腫瘤區域利用合適的熱源加熱至41～43 ℃并保持一定時間，從而達到抑制腫瘤作用的一種方法。在臨床上，單純熱療對腫瘤的抑制作用效果不明顯。最新研究[8]發現，熱療與抗腫瘤藥物聯合使用，可促進抗腫瘤藥物的抗腫瘤效果。本研究通過探討小檗胺聯合熱療對人胃癌順鉑耐藥細胞(SGC-7901/DPP)增殖的影響， 研究其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

胎牛血清和達爾貝科極限必需培養液(dulbecco minimum essential medium,DMEM)培養液購于Thermo Fisher Scientific公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑以及小檗胺化合物購于Sigma公司；SGC-7901/DPP細胞株購買于上海中科院細胞庫；蛋白質印跡技術(Western blot)實驗相關抗體購于Abcam公司。膜連蛋白 V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡試劑盒購于北京碧云天生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

SGC-7901/DPP細胞培養于DMEM培養液培養(培養液含有10%的胎牛血清、0.1 U/L青霉素和100 g/L鏈霉素)；培養條件為：細胞培養箱內(37 ℃，5% CO2)常規培養。

1.3 細胞處理

細胞根據不同的處理方式分為：1)對照組：SGC-7901/DPP細胞于培養箱中進行常規培養；2)熱療組: 利用恒溫43 ℃處理SGC-7901/DPP細胞48 h；3)小檗胺組：利用小檗胺(16 mg/L) 處理SGC-7901/DPP細胞48 h； 4)小檗胺聯合熱療組：小檗胺(16 mg/L)聯合恒溫43 ℃處理SGC-7901/DPP細胞48 h。

1.4 MTT實驗檢測細胞增殖能力

SCG-7901/DPP細胞(1×104個/孔)于96孔板中接種， 培養24 h 后用不同濃度的小檗胺(0～64 mg/L)或者按照1.3分組處理細胞，于48 h后在96孔板中每孔加入20 μL MTT，繼續培養4 h 后于每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)， 在570 nm 波長處測定吸光度A值， 抑制率/%=(570 nmA值：對照組-570 nmA值：實驗組)/570 nmA值：對照組×100%。

1.5 細胞集落形成試驗檢測細胞生長能力

細胞按照1.3分組處理48 h后，SGC-7901/DPP細胞于6 孔培養板接種，連續培養10 d，每隔3 d更換1 次培養基，每組3個復孔。于10 d后， 將細胞利用75%乙醇固定，然后利用0.5%結晶紫染色。顯微鏡下觀察拍照，并計算集落數量。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

細胞按照1.3分組處理48 h后， 用PBS洗滌SGC-7901/DPP細胞，將細胞利用70% 冷乙醇固定后，與RNA 酶反應過夜，然后將反應的細胞與碘化丙啶染液混勻后， 細胞分析采用流式細胞儀，激發波長為488 nm，細胞凋亡率采用Modfit LT 2.0 軟件分析。

1.7 Western blot檢測細胞中蛋白水平

細胞按照1.3分組處理48 h后， 利用含有蛋白酶抑制劑(RIPA)緩沖液裂解SGC-7901/DPP細胞進行蛋白的提取。 蛋白濃度的測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行。 將等量總蛋白(20 g)利用10% SDS-PAGE凝膠電泳， 然后利用半干法將電泳蛋白轉移至PVDF膜，PVDF膜于室溫利用TBST溶液(含有5%脫脂奶粉) 封閉1 h，TBST 洗滌，然后與不同的一抗于4 ℃冰箱孵育過夜。 將冰箱孵育過夜的PVDF膜利用TBST洗滌3 次之后，與辣根果氧化物酶標記的二抗于室溫孵育1 h，利用ECL試劑盒曝光顯影。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 小檗胺對SGC-7901/DPP細胞的增殖影響

利用不同濃度的小檗胺(0～64 mg/L)處理SGC-7901/DPP細胞48 h 后， MTT實驗檢測SGC-7901/DPP 細胞活性，發現小檗胺在16 mg/L時，對SGC-7901/DPP 細胞增殖抑制達到了(21.3±3.1)%，隨著濃度的升高，小檗胺對SGC-7901/DPP細胞增殖的抑制沒有明顯提高，抑制率分別為 (22.5±5.6)%和(23.5±4.5)% 。因此本研究選擇了16 mg/L 小檗胺作為后續的聯合熱療實驗(表1)。

表1 小檗胺對SGC-7901/DPP細胞增殖的影響

2.2 小檗胺聯合熱療對SGC-7901/DPP細胞增殖、凋亡的影響

MTT實驗結果顯示，與對照組相比，單獨熱療處理或者單獨小檗胺 (16 mg/L)處理可抑制SGC-7901/DPP細胞增殖，抑制率分別為(17.2 ± 4.5)%和(23.3 ± 6.0)%；小檗胺聯合熱療處理SGC-7901/DPP細胞可進一步抑制細胞增殖，抑制率為(70.9 ± 7.5)%，與單獨熱療組或者小檗胺組相比差異有統計學意義(P<0.01)。集落形成實驗結果顯示，與對照組相比，單獨熱療處理或者單獨小檗胺 (16 mg/L)處理可以抑制SGC-7901/DPP細胞的集落形成數量，抑制率分別為30.3%和37.0%；小檗胺聯合熱療處理SGC-7901/DPP細胞可進一步抑制細胞的集落形成數量，抑制率為72.6%，與單獨熱療組或小檗胺組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。流式細胞技術實驗結果顯示，與對照組相比，單獨熱療處理或者單獨小檗胺 (16 mg/L)處理可以增加SGC-7901/DPP細胞的凋亡比例，凋亡率增加分別為(21.5±4.5)%和(23.9±5.7)%；與單獨熱療組或者小檗胺組相比，小檗胺聯合熱療處理SGC-7901/DPP細胞可以進一步增加SGC-7901/DPP細胞的凋亡比例(P<0.05)(表2)。

表2 小檗胺聯合熱療對SGC-7901/DPP細胞增殖、凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與熱療組比較，#P<0.05，##P<0.01；與小檗胺組比較，&P<0.05,&&P<0.01

2.3 小檗胺聯合熱療影響SGC-7901/DPP細胞凋亡相關蛋白表達水平

小檗胺聯合熱療對SGC-7901/DPP細胞凋亡相關蛋白的影響利用Western blot檢測，與對照組相比，單獨熱療組和小檗胺組(16 mg/L)處理能夠降低Bcl-2的蛋白水平，同時提高Bax，cleaved caspase-3以及cleaved caspase-9的蛋白水平(P<0.05)。與單獨熱療組或者小檗胺組(16 mg/L)相比，小檗胺聯合熱療組中 Bcl-2的蛋白水平降低，Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 的蛋白水平明顯提高(P<0.05)(圖1)。

注：A: Western blot 檢測各組SGC-7901/DPP細胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 蛋白的表達；B: 各組SGC-7901/DPP細胞中Bcl-2蛋白表達水平的統計分析；C: 各組SGC-7901/DPP細胞中Bax蛋白表達水平的統計分析；D: 各組SGC-7901/DPP細胞中cleaved caspase-3蛋白表達水平的統計分析；E：各組SGC-7901/DPP細胞中cleaved caspase-9蛋白表達水平的統計分析；1：對照組；2：熱療組；3：小檗胺組；4：小檗胺聯合熱療組；與對照組比較，*P<0.05；與熱療組比較，#P<0.05；與小檗胺組比較，&P<0.05

2.4 小檗胺聯合熱療抑制SGC-7901/DPP細胞耐藥相關蛋白的表達水平

小檗胺聯合熱療對SGC-7901/DPP細胞凋亡相關蛋白的影響利用Western blot檢測，與對照組相比，單獨熱療組和小檗胺組(16 mg/L)處理能夠明顯降低多藥耐藥基因1(multidrug resistance protein 1， MDR1)以及多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)的蛋白水平(P<0.05)。與單獨熱療組或小檗胺組(16 mg/L)相比，小檗胺聯合熱療組的MDR1以及MRP1蛋白水平明顯降低(P<0.05)(圖2)。

圖2 小檗胺聯合熱療抑制SGC-7901/DPP細胞耐藥相關蛋白的表達水平

注：A: Western blot 檢測各組SGC-7901/DPP細胞中MDR1和MRP1蛋白的表達；B: 各組SGC-7901/DPP細胞中MDR1蛋白表達水平的統計分析；C: 各組SGC-7901/DPP細胞中MRP1蛋白表達水平的統計分析；1：對照組；2：熱療組；3：小檗胺組；4：小檗胺聯合熱療組；與對照組比較，*P<0.05; 與熱療組比較，#P<0.05；與小檗胺組比較，&P<0.05

3 討論

胃癌治療的方法主要包括手術治療、放射治療和化療。 多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的發展大大降低了化療的療效， 減輕MDR的發展可以恢復癌細胞對化療的敏感性。 研究[9]發現，MDR相關蛋白的表達在MDR的發生發展中起著至關重要的作用。在臨床上，熱療作為一種輔助治療腫瘤的手段聯合化療已經收到越來越多的關注，并且已在相關腫瘤治療中獲得了應用[10]。小檗胺具有免疫保護功能和活性，如刺激正常造血功能，具有抗炎和抗心律失常等作用[11-13]。雖然有研究[3-7]表明，小檗胺對不同類型的腫瘤有抑制作用，但其對胃癌的作用尚不明確，機制尚不清楚。本研究發現，小檗胺聯合熱療可以有效抑制SGC-7901/DPP細胞的增殖，增加SGC-7901/DPP細胞凋亡，同時抑制MDR1和MRP1的蛋白水平，比單獨熱療或單獨使用小檗胺更有效。

小檗胺可以抑制不同類型腫瘤細胞的增殖，這種抑制作用可能是通過觸發凋亡途徑發揮其抗腫瘤活性，并調節參與癌癥進展的信號通路。凋亡信號傳導途徑的異常與癌癥發生有著緊密聯系。許多抗癌化合物通過激活凋亡途徑發揮其抗癌作用。在胰腺癌中，小檗堿能夠增加胰腺癌細胞中的Bax/Bcl-2比例，增強caspase-3和caspase-9的蛋白水平，從而誘導胰腺癌細胞中的細胞凋亡[4]。Zhang等[5]發現，小檗胺能夠提高促凋亡Bax蛋白的水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達，從而導骨髓瘤細胞凋亡。 Wang等[14]研究發現，小檗胺能增加Fas、 p53、caspase-3和caspase-8、caspase-9蛋白的表達，從而促進HepG2細胞凋亡。最新研究[5]發現，小檗胺能夠通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制卵巢癌細胞的增殖，并促進其凋亡。Zhang等[7]研究也發現，小檗胺通過p53依賴機制促進結腸癌細胞的凋亡。本研究中，小檗胺聯合熱療能夠促進SGC-7901/DPP細胞的凋亡，這種促進凋亡作用可能與Bcl-2蛋白水平的降低，以及caspase-3、caspase-9和Bax蛋白水平升高有關。

MDR是治療癌癥的主要障礙，包括主要導致化療失敗的胃癌治療。MDR1基因編碼屬于ATP結合盒轉運蛋白超家族的P-糖蛋白(P-gp)。 P-gp能夠將化療藥物轉運出細胞，導致藥物積聚下降，進而導致MDR[15-16]。 MRP1也屬于ATP結合盒轉運蛋白超家族，MRP1導致MDR的作用機制與MDR1相似[17]。本研究中，小檗胺聯合熱療處理，可降低SGC-7901/DPP細胞的MDR1以及MRP1蛋白水平，提示小檗胺聯合熱療抑制SGC-7901/DPP細胞增殖可能與抑制MDR1以及MRP1蛋白水平有關。

綜上所述，小檗胺聯合熱療對SGC-7901/DPP的增殖抑制作用可能通過調控凋亡相關蛋白，促進SGC-7901/DPP凋亡以及抑制MDR1和MRP1蛋白水平有關。未來將在以下幾個方面開展研究工作：探索小檗胺聯合熱療能否降低SGC-7901/DPP的耐藥性；探討小檗胺聯合熱療對SGC-7901/DPP耐藥性的相關分子信號通路的影響；進一步研究小檗胺聯合熱療對其他類型的耐藥性癌細胞增殖的影響；利用動物腫瘤模型進一步確認小檗胺聯合熱療的體內抗腫瘤活性。