人肝細胞癌中TRIM59與E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白表達在腫瘤侵襲及轉移中的相關性研究*

劉子源，孫 綱，曹 群，盧光輝，邵潤東

1.大連醫科大學(大連 116021)；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第967醫院(大連 116021)；3.錦州醫科大學(錦州 121000)

TRIM59蛋白屬于TRIM三基序家族的一員，2011 年被證實是多種癌癥的致癌性基因，其具有1個ring finger domain、1個B-box domain、2個卷曲螺旋和1個跨膜結構域。目前研究[1-4]發現TRIM59在肝癌、胃癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌和神經膠質瘤等多種惡性腫瘤中表達上調，其在惡性腫瘤的侵襲、遷移、增殖和凋亡等多過程中也發揮著重要效應。

E-鈣粘蛋白及N-鈣粘蛋白均為經典鈣粘蛋白，與腫瘤細胞成纖維細胞樣形態改變相關，可增加腫瘤細胞活動性，使其更易發生侵襲和轉移。研究[5-8]發現其在肝癌發生過程中發揮重要作用。因此，研究TRIM59與E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白相關性可能對早期肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的診斷和治療提供新的契機。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與轉染

實驗中所需細胞株購于美國ATCC。Huh7細胞在DMEM(美國Gibco)中培養。Hep3B、HepG2 和 SK-Hep1細胞在EMEM (美國Gibco)中培養。 BEL7402、LO2、SMMC7721及RPMI 1640細胞在培養基(美國Gibco)中培養。所有培養基均添加10%胎牛血清(美國Gibco)和1%青霉素/鏈霉素(中國Beyotime生物研究所)。細胞在37 ℃，5%CO2的潮濕培養箱中培養。預實驗選擇HCC研究熱點Huh7、Hep3B、HepG2、SK-Hep1、 BEL7402、SMMC7721，增加實驗可靠性，根據最終實驗結果選擇進一步研究的細胞。用脂質體3000(美國Invitrogen)將質粒導入所有細胞。

1.2 質粒和慢病毒

用PCR方法從小鼠E17 Clontech Laboratories 中擴增TRIM59。包含TRIM59 cDNA的結果碎片被亞克隆到pcDNA 3.1載體上。使用慢病毒顆粒直接感染HepG2和Huh7細胞。隨后用普羅霉素(美國Sigma)選擇穩定的克隆。對選擇的細胞群體進行免疫印跡，研究敲除效率(實驗所需抗TRIM59及TRIM59慢病毒結構來自美國Santa Cruz。

1.3 定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

用RNeaseMini試劑盒(德國Qiagen)從細胞中提取總RNA。TRIM 59和家養基因β-actin的定量實時聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 以10 μL為最終體積進行，其中含有5 μL的SsoFastTMEvaGreen超級混合物(美國Bio-Rad 實驗室), 1 μL的cDNA，正反兩對引物各1 mm。TRIM59的引物是5′-tac gag agc agc tgg aa-3′和5′-acg ggt tga acc tca gga ag-3′。β-肌動蛋白的引物是5′-agt act ccg tgt gga tc g gc-3′和5′-gct gat cca cat ctg ctg ga-3′。在Applie d Biosystems 7500實時PCR循環儀上進行qRT-PCR。目標基因的表達針對housekeeping水平進行標準化。結果表示TRIM59 mRNA表達的水平。

1.4 碳酸脂膜實驗

將細胞懸液(200 μL)以1×105個細胞/孔注入涂有Martrigel(中國Corning)的上室中，將含有10%FBS(650 G)的培養基加入下室中。24 h后，用棉簽去除未穿透細胞。細胞經4%甲醛固定后，用0.1%結晶紫染色。根據光學顯微鏡隨機選擇區域中的細胞總數定義細胞的侵襲能力。

1.5 劃痕試驗

HepG2和Huh7細胞以4.0×105個/mL進行接種。24 h后，使用20-μL移液器芯片將匯合的單層細胞行線性劃痕。使用有照相機的顯微鏡在刮擦后立即拍攝記錄，48 h時拍攝劃痕區域。 數據用Image J軟件進行分析。

1.6 蛋白質印跡法

將來自細胞系的總蛋白在裂解緩沖液(瑞士Roche)中提取并使用Bradford方法進行鑒定。用SDS-PAGE法分離蛋白，轉化后，將硝酸纖維素濾膜(NC)膜(中國PALL)與小鼠或兔免疫球蛋白G抗體連同原抗體共同孵育，增強化學發光系統(ECL，美國Bio-Rad實驗室)和GAPDH 結合的辣根過氧化物酶對照。用校準的GS-670密度計測定蛋白質條帶的密度量化變化。分別獨立進行3個實驗過程。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 TRIM59在HCC細胞的表達

實驗發現與正常人肝細胞(LO2)細胞比較，TRIM59 mRNA表達水平在各系HCC細胞系中均為高表達，其中在Huh7和 HepG2中TRIM59 mRNA表達水平最明顯。使用蛋白質印跡技術進一步分析發現，TRIM59的蛋白質表達水平也呈高表達，特別是在Huh7和 HepG2中表達水平最為明顯(圖1)。

圖1 TRIM59在HCC細胞系中上調

2.2 TRIM59對HCC細胞遷移和侵襲的影響

使用劃痕實驗和Transwell試驗進一步評估TRIM59在HCC細胞遷移和侵襲中的作用。在劃痕試驗中，48 h后shControl組中傷口基本為遷移的細胞所愈合，而TRIM59的敲除則減弱了該傷口的愈合進度，TRIM59的過表達通過HepG2和Huh7細胞中的劃痕實驗表明TRIM59能促進細胞轉移。在Transwell試驗中，結果顯示TRIM59敲除將會顯著降低侵襲細胞的數量，而TRIM59過表達可增加侵襲細胞的數量，進而促進HepG2和Huh7細胞的遷移和侵襲能力。以上實驗結果表明TRIM59有助于HCC細胞的遷移和侵襲(圖2)。

圖2 TRIM59對HCC細胞遷移和侵襲的生物學功能

注：A、B：劃痕試驗。 具有shTRIM 59-1、shTRIM 59-2或shControl(A)的HepG 2及Huh 7細胞轉染pcDNA3.1-載體或pcDNA3.1-TRIM 59表達質粒(B)將細胞培養成單層細胞，刮擦以產生劃痕傷口

2.3 TRIM59對E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白表達的干預

為研究TRIM59調節細胞遷移和侵襲的分子機制，采用蛋白質印跡法檢測在細胞轉移中起重要作用的E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白的表達水平。TRIM59的敲除顯著降低了E-鈣粘蛋白表達，同時增加HepG2和Huh7細胞中的N-鈣粘蛋白表達；相反，TRIM59過度表達會上調E-鈣粘蛋白表達并降低N-鈣粘蛋白的表達。本實驗表明TRIM59可能通過干預E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白來調節HCC細胞的轉移(圖3～4)。

圖3 TRIM59對HCC細胞遷移和侵襲的生物學功能

圖4 TRIM59調節E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白表達

注：A：蛋白質印跡法分析沉默TRIM59表達的HepG2和Huh7細胞系中E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白的表達；B：使用Westernblot分析pcDNA3.1-Vector或pcDNA3.1-TRIM59瞬時轉染時E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白的表達

3 討論

原發性肝癌占所有腫瘤的7%，其中90%為HCC[9]。HCC發病率居世界第5位、病死率居第3位[10]，其中中國HCC病死數占全球總數的51%(38．3萬人/年)[11]，且70%新發病例來自亞洲(50%來自中國)[12]。隨著經濟水平和人民健康意識的提高及對肝癌普查范圍和強度的擴大，中國部分肝癌患者得以早期發現、早期治療從而改善肝癌的發病[13]。因此，更好地掌握HCC的微觀分子機制對于早期診斷干預HCC具有重要意義。TRIM59可通過多種途徑參與介導腫瘤的發生與發展。TRIM59是一種新型生物標志物，具有致癌活性，在不同惡性腫瘤中表達上調，且與臨床分期、淋巴結轉移及預后有關。 TRIM59可通過多種機制影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和遷移，如調控 p53、影響細胞周期、調節EMT途徑、激活 Ras/RB、PI3K/AKT和TGF-β/Smad2/3信號通路等。但目前對 TRIM59的研究僅限于部分腫瘤， 對其作用機制研究更少，尤其在化療耐藥、自噬、血管生成等方面。 因此，深入研究 TRIM59在惡性腫瘤中的作用機制及 TRIM59多態性在預測惡性腫瘤風險中的作用，有望為早期診斷治療惡性腫瘤提供新的思路[14]。E-鈣粘蛋白是細胞間連接的重要構成部分，E-鈣粘蛋白通常作為檢測細胞發生EMT的首選因子[15]。據研究報道，E-鈣粘蛋白在HCC的侵襲及轉移中具有重要意義。N-鈣粘蛋白在HCC等多種惡性腫瘤中使得腫瘤細胞活動性增加，從而更容易侵襲和轉移。

本實驗研究了TRIM59在HCC細胞中的生物學功能。結果表明，TRIM59及其蛋白質表達產物在HepG2和Huh7細胞中最為顯著。研究[16]表明，HepG2和Huh7細胞比其他細胞系更加敏感。使用shControl，shTRIM59-1或shTRIM59-2慢病毒感染HepG2和Huh7細胞，通過普羅霉素篩選并經過蛋白質印跡法驗證，TRIM59的表達量明顯下降，表明TRIM59敲除有效，該結果符合本實驗目的。用pcDNA3.1-Ve ctor或pcDNA3.1-TRIM59表達質粒轉染HepG2細胞和Huh7細胞，用來研究TRIM59對HCC細胞遷移和侵襲的生物學功能。 在劃痕試驗中用shTRIM 59-1、shTRIM 59-2或shControl或shControl和HepG 2及Huh 7細胞穩定的HepG 2和Huh 7細胞將轉染pcDNA3.1-載體或pcDNA3.1-TRIM 59表達質粒的Huh 7細胞培養成單層細胞。將單層刮成直線刮擦以產生劃痕傷口。48 h后，shControl組的傷口基本為遷移的細胞所愈合，TRIM59敲除組減慢了傷口的愈合，TRIM59過表達組卻促進了細胞遷移和傷口的愈合。在transwel試驗中，用pcDNA3.1-Vector或pcDNA3.1-TRIM59表達質粒轉染的shTRIM59-1，shTRIM59-2和shControl以及HepG2和Huh7細胞的穩定HepG2和Huh7細胞在transwell小室中培養。用Martrigel處理24 h，將細胞固定，染色并隨機計數，研究發現TRIM59敲除組顯著降低了侵襲細胞的數量；而TRIM59過表達組卻顯著增加了侵襲細胞的數量。實驗結果表明TRIM59有助于HCC細胞的遷移和侵襲。研究結果表明TRIM59在肝癌細胞中高表達。此外，本研究發現TRIM59的敲除顯著降低E-鈣粘蛋白表達，同時增加HepG2和Huh7細胞中N-鈣粘蛋白表達；相反，TRIM59過度表達會上調E-鈣粘蛋白表達并降低N-鈣粘蛋白的表達。這些研究表明TRIM59可能通過干預E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白來調節HCC細胞的侵襲及遷移。

綜上所述，本研究結果表明TRIM59在HCC中的高表達及TRIM59可促進HCC侵襲和遷移的能力。與此同時，TRIM59可能通過上調E-鈣粘蛋白表達并降低N-鈣粘蛋白的表達來調節HCC細胞的侵襲及遷移。本次研究加深了我們對HCC發展轉移的認識，同時也可將TRIM59作為HCC治療的一個潛在的作用靶點。