上海地區健康豬群中副豬嗜血桿菌的分離鑒定

寧 昆 沈莉萍 徐 鋒

（上海市動物疫病預防控制中心， 上海 201103）

副豬嗜血桿菌病又稱豬革拉斯病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS） 引起豬的一種以高熱、呼吸道紊亂、關節腫脹、中樞神經癥狀及高死亡率為特征的疾病。該病在臨床上以多發性關節炎和漿膜炎為主要病變特征，又稱多發性纖維素性漿膜炎和關節炎。HPS 血清型眾多，可分為15 個血清型，命名為1～15 型，另有約20%分離株尚不能分型。HPS 屬于典型的“機會主義”病原，在機體遭受應激或感染病毒性疾病（如高致病性豬藍耳病、圓環病毒感染、豬瘟）導致免疫力下降時，可以侵入機體引起發病[1]。本菌可使2周齡到4 月齡的豬感染發病，尤其以5 周齡至8 周齡斷奶前后和保育階段的豬比較常見，發病率10%～15%，病死率可達50%[2]，給養豬業帶來重大經濟損失，嚴重威脅著全世界養豬業的健康發展。

本研究通過對上海地區健康豬群進行監測，以期了解副豬嗜血桿菌在健康豬群中的攜帶情況，為上海地區副豬嗜血桿菌病的防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

2018 年在上海2 個規模化豬場采集豬唾液20 份、豬鼻拭子60 份。所采集的樣品經保溫箱運回實驗室，當天進行檢測。

1.1.2 培養基和試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、Columbia 血瓊脂基礎購自BD 公司，輔酶I（NAD）購自上海如吉生物科技發展有限公司；無菌脫纖維羊血購自杭州新銳生物工程有限公司；小牛血清購自Thermo 公司；Premix 購自TaKaRa 公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；質譜樣品處理基質液（VITEK MS-CHCA）購自生物梅里埃公司；微量生化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 標準菌株

副豬嗜血桿菌HP80 由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所惠贈，金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸埃希菌ATCC 8739 購自ATCC。

1.1.4 儀器

全自動快速微生物質譜檢測系統（VITEK MS）購自生物梅里埃公司；PCR 儀（PTC-200）購自伯樂公司；恒溫箱購自Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養

在生物安全柜中用接種環蘸取樣品，劃線接種于含5%小牛血清和0.1 g/mL 的TSA 平板上，于37℃培養48 h；挑取可疑菌落進行革蘭氏染色；挑取可疑菌落，接種于含5%小牛血清和0.1 g/mL 的TSA 平板進行純培養。

無菌挑取純培養后的菌落，平行劃線于無NAD 的綿羊血平板上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線接種，于37℃培養24～48 h，觀察菌落生長情況。

1.2.2 細菌的生化、PCR 和質譜鑒定

挑取可疑菌落分別接種于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和木糖微量生化鑒定管中，鑒定管中每管按10 μg/mL 終濃度的NAD，于37℃培養24 h。同時，對可疑菌落進行硝酸鹽還原試驗、尿素酶試驗和氧化酶試驗。

挑取3～5 個可疑菌落于含100 μL 去離子水的離心管中，100℃水浴10 min，8 000 r/min 離心5 min，吸取上清作為模板。使用筆者團隊設計的副豬嗜血桿菌16s rRNA 引物（見表1）進行擴增。副豬嗜血桿菌反應體系如下：premix 12.5 μL，DEPC 水8.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL；反應條件為：95℃2 min；94℃30 s，58℃1 min，72℃1.5 min，擴增33 個循環；72℃延伸10 min。

于鑒定前一天接種副豬嗜血桿菌HP80 和質控株ATCC 8739，使用全自動快速微生物質譜檢測系統（VITEK MS） 按照操作步驟對HP80、ATCC8739 和可疑菌落進行鑒定，讀取鑒定結果。

2 結果

2.1 分離培養

經48 h 培養，TSA 平板上生長出的可疑菌落直徑約1～2 mm，不溶血、半透明、圓形隆起、邊緣整齊、光滑濕潤。經革蘭氏染色，可疑菌落呈革蘭氏陰性短桿狀，大小約0.5 μm×（1.5～2.0） μm。將可疑菌落純培養，24 h 后出現上述菌落形態。

可疑菌落和金黃色葡萄球菌一起培養后出現“衛星生長現象”，即在金黃色葡萄球菌旁邊的可疑菌落較大，遠離金黃色葡萄球菌的可疑菌落較小。

2.2 鑒定

可疑菌落的生化試驗結果見表2，可以看到，所分離的細菌發酵葡萄糖、半乳糖，不發酵乳糖、甘露醇和木糖。觸酶試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，尿素酶試驗陰性，氧化酶試驗陰性。

表2 細菌的生化反應結果

PCR 檢測結果見圖1，可疑菌落出現275 bp 的目的條帶，20 份豬唾液中檢測出1 份陽性，60 份豬鼻拭子中檢測出5 份陽性。

使用VITEK MS 對可疑菌落進行蛋白質譜鑒定，見圖2，結果與數據庫中的副豬嗜血桿菌同源性達到75%以上。綜合上述分離鑒定結果，判定為副豬嗜血桿菌。

圖1 副豬嗜血桿菌的PCR 鑒定結果

圖2 副豬嗜血桿菌的質譜鑒定圖

3 討論

副豬嗜血桿菌病相對于其他疾病較難防控的原因有：一是目前該菌已確定的血清型有15 種，各血清型之間的交叉保護力較弱或者沒有。有研究表明，已經接種過滅活菌苗的豬群也會因缺乏交叉保護而致免疫失敗。二是該菌屬于機會性致病菌，在豬群整體狀態較好時不發病，容易被豬場管理者忽視，但是在豬群存在豬藍耳病或圓環病毒病時，HPS 易繼發感染，該菌的分離率會增加[3]；或者在豬群遇到氣溫驟降、運輸等應激條件下，也會增加感染的風險[4]。因此，防治本病的前提是做好飼養管理，提高豬群免疫力，采取疫苗加抗生素相結合的綜合防控措施。具體來講，需要做到如下幾點。

一是加強飼養管理，改善飼養條件。保育階段是豬發生副豬嗜血桿菌病的高發年齡段，在仔豬斷奶后到保育舍時，由于保育舍溫度較低，仔豬受到寒冷應激之后抵抗力下降，此時容易感染副豬嗜血桿菌這類條件致病菌。所以在轉舍時，將保育舍的溫度提高到同產房的溫度，而后每天緩慢降低。

二是做好免疫抑制性疾病的預防。副豬嗜血桿菌常繼發于圓環病毒病、藍耳病和支原體肺炎等免疫抑制性疾病，所以對于本病的預防應該從這幾種病入手，做到及時免疫。

三是合理使用藥物。副豬嗜血桿菌對恩諾沙星、頭孢噻呋等比較敏感。對于本病的治療應該盡早，如果在發病后期則治愈率較低。同時，在治療時一定要找到病因，找到原發病，然后配合該菌的敏感藥物就可以較好地治愈本病。