畢赤酵母表達環狀芽胞桿菌殼聚糖酶及其水解產物組成與結構分析

程 功，焦思明，賈培媛，任立世，馮 翠，張毓宸，李建軍，杜昱光

(中國科學院 過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190)

殼寡糖是甲殼素或者其脫乙酰產物殼聚糖經物理、化學或酶學等方法降解產生的寡聚物，由氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成，通常聚合度小于20[1]。研究顯示，殼寡糖具有抗炎、抗腫瘤及激活植物免疫等一系列生物活性[2-5]。在工業上，殼寡糖主要通過以下方式獲得：蝦蟹殼經酸法脫鈣及堿法脫蛋白后得到甲殼素，經高濃度強堿脫乙酰得殼聚糖，再經酶法水解等方式最終獲得殼寡糖[6]。現有制備工藝生產的殼寡糖的脫乙酰度通常高于85%，組分種類較少，主要為聚合度小于10的全脫乙酰殼寡糖。

殼寡糖生物活性的發揮與其結構，如聚合度及脫乙酰度甚至乙?；诠烟擎溕系姆植嫉让芮邢嚓P[7]。然而，現有殼寡糖的工業制備過程中已經脫去大部分的乙?；?，且通常使用非特異性商品酶類，如纖維素酶[8]、蛋白酶[9]及脂肪酶[10]等對殼聚糖進行水解，難以實現產物殼寡糖結構的有效調控。為解決上述難題，擬對工藝進行如下改進：制備脫乙酰度小于80%的殼聚糖，篩選并高效表達殼聚糖水解酶類，利用這些酶類水解低脫乙酰度底物，獲得特定結構殼寡糖。

殼聚糖酶(chitosanase，EC 3.2.1.132)可通過內切方式對殼聚糖底物進行水解，產物即為殼寡糖。根據殼聚糖酶對殼聚糖底物水解位點識別的差異，可將其大致分為3種類型：Ⅰ型殼聚糖酶可同時識別并水解GlcN-GlcN及GlcNAc-GlcN糖苷鍵，Ⅱ型殼聚糖酶僅識別并水解GlcN-GlcN糖苷鍵，Ⅲ型殼聚糖酶可同時識別并水解GlcN-GlcN及GlcN-GlcNAc糖苷鍵[11]。利用這些不同水解類型的殼聚糖酶，可以制備不同結構特征的殼寡糖。Chen等[12]已經在畢赤酵母中高效表達了來源于煙曲霉的殼聚糖酶，該酶屬于Ⅰ型殼聚糖酶[13]。Saito等[14]已證實來源于環狀芽胞桿菌的殼聚糖酶屬于Ⅲ型殼聚糖酶。目前，尚無該酶在畢赤酵母中表達的研究報道。與其他表達系統相比，畢赤酵母表達系統結合高密度發酵可實現蛋白高效分泌表達，已在工業及食品用酶制劑領域取得較廣泛應用。

因此，本研究中，筆者選擇利用該表達系統對來源于環狀芽胞桿菌的殼聚糖酶進行表達，利用產物酶水解制備低脫乙酰度殼寡糖并對其組成及結構特征進行分析，為特定結構類型殼寡糖的功能研究及應用提供必要前提。

1 材料與方法

1.1 材料

甲殼素，Sigma-Aldrich公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、T4連接酶及E.coliDH5α化學感受態細胞，寶日醫(北京)生物技術有限公司；畢赤酵母表達載體pPIC9，優寶生物，pGBG1為pPIC9信號肽核酸序列根據畢赤酵母密碼子的偏好性優化后的載體[15]；畢赤酵母GS115、XhoⅠ、NotⅠ、BglⅡ及色譜純乙腈，美國Thermo Fisher公司；蛋白Marker，上海天能科技有限公司。其他試劑均為市售分析純。畢赤酵母培養基MD、BMGY和BMMY的配制方法及電轉化感受態細胞制備方法均參考畢赤酵母表達手冊，美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器

ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Waters XEVO G2-S QTOF型質譜儀(配有Lock-spray 接口、電噴霧離子源(ESI)及Masslynx 4.1質譜工作站軟件)，美國Waters公司；AVANCE Ⅲ 600 MHz型核磁共振儀，Bruker公司；DYY-6C型核酸及蛋白電泳系統，北京六一生物科技有限公司；Tanon-1600型凝膠成像系統，上海天能科技有限公司；MicroPulserTM電轉儀，美國Bio-Rad公司；LGJ-10FD型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司；RE-2000B型旋轉蒸發器，鞏義市英峪高科儀器廠；L535R型低溫冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 環狀芽胞桿菌殼聚糖酶基因序列優化、全合成及表達載體構建

使用畢赤酵母偏好的密碼子，對環狀芽胞桿菌菌株MH-K1[14]的殼聚糖酶(GenBank登錄號:BAA01474，43-301)編碼基因序列進行優化，在5′及3′末端分別添加XhoⅠ及NotⅠ酶切位點序列。委托北京擎科新業生物技術有限公司將設計好的基因序列進行全合成。利用內切酶XhoⅠ及NotⅠ回收載體pUC18上的目的基因片段，使用T4連接酶連接至相同內切酶水解的表達載體pGBG1中，轉化至E.coliDH5α化學感受態細胞中。使用酶切及雙末端測序方法對構建表達載體的正確性進行驗證。

1.3.2 環狀芽胞桿菌殼聚糖酶畢赤酵母表達

使用BglⅡ對重組質粒進行線性化并切膠回收目的基因，電轉至畢赤酵母GS115中。使用MD平板篩選獲得重組子，轉接至含有膠體殼聚糖(質量分數0.5%)的BMMY瓊脂平板上，在30 ℃條件下培養2～3 d，篩選出水解圈最大的菌落。將菌落接種于200 mL BMGY培養基中，在28 ℃、250 r/min條件下培養48 h，離心棄上清，加入200 mL的BMMY誘導表達。后續每隔24 h補加1次甲醇至其終體積分數為1%，共計誘導120 h后離心收集上清液。使用SDS-PAGE法檢測上清液中的蛋白表達情況，Bradford法測定上清的蛋白濃度。

1.3.3 低脫乙酰度殼寡糖制備及組成分析

使用表達的殼聚糖酶水解脫乙酰度為62%的殼聚糖[15]制備殼寡糖，具體方法如下：稱取50 g殼聚糖，加至1 000 mL水中，加入乙酸溶解并調節至pH 6.0；再加入10 mL殼聚糖酶，在40 ℃條件下攪拌反應48 h；離心去除不溶物，使用旋轉蒸發儀將上清濃縮至約300 mL后凍干。稱取10 mg殼寡糖凍干樣品，使用超純水配制成1 mg/mL溶液。

液相檢測條件：使用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min，15% A；2～32 min，15%～50% A；32～33 min，50%～80% A；33～36 min，80% A；36～37 min，80%～15% A；37～44 min，15% A)，柱溫為35 ℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為1 μL。

質譜檢測條件：ESI源，正離子掃描模式，毛細管電壓為3 kV，錐孔電壓為60 V，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，錐孔氣流量為50 L/h，脫溶劑氣流量為800 L/h，碰撞能量為30～60 V，離子能量為3 V，每0.25 s采集1次圖譜；質量掃描范圍為150～2 000m/z。

使用Masslynx 4.1軟件對獲取的液質結果進行分析，以獲得潛在的殼寡糖信息。依據一級質譜信息進行潛在殼寡糖組分的組成分析，具體方法如下：首先建立聚合度為2～20的所有可能結構殼寡糖的H+、Na+和K+衍生物及多電荷離子的理論質荷比(m/z)數據庫，如含有4個N-乙酰氨基葡萄糖(A)及8個氨基葡萄糖(D)的殼寡糖(D8A4)不同正離子衍生物及其理論m/z值包括[D8A4+H]+/2 119.9、[D8A4+Na]+/2 141.9、[D8A4+K]+/2 157.9、[D8A4+2H]2+/1 060.5及[D8A4+3H]3+/707.3等，將測定的m/z值與數據庫中殼寡糖的理論m/z值對比，即可推測產物殼寡糖的潛在組成。

1.3.4 低脫乙酰度殼寡糖結構特征分析

使用液體1H NMR及13C NMR分別對制備的殼寡糖的還原端及非還原端單糖組成進行分析，具體方法：稱取25 mg制備的殼寡糖凍干樣品，加入0.50 mL D2O，待其充分溶解后加樣檢測。以3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4鈉鹽為內標，使用AVANCE III 600MHz型核磁共振儀對樣品進行檢測，其中，1H NMR檢測時對水峰進行抑制以減少干擾。獲得的原始數據使用MestReNova軟件打開后，使用內標校正位移值后，參照文獻[16]對特定部位單糖進行標記，具體的參考位移值包括1H NMR中的還原端氨基葡萄糖(-D，δ5.43)、還原端N-乙酰氨基葡萄糖(-A，δ5.19)以及13C NMR中5位碳(C5)的非還原端氨基葡萄糖(D-，δ79.0)及非還原端N-乙酰氨基葡萄糖(A-，δ78.5)等。

2 結果與討論

2.1 殼聚糖酶基因優化、全合成及畢赤酵母表達

環狀芽胞桿菌菌株MH-K1殼聚糖酶編碼基因長度為906 bp，編碼蛋白包含301個氨基酸，在蛋白的氨基末端包含1個信號肽。將密碼子優化后的基因命名為bccsn(GenBank:MG595777)。使用酶切方法對構建好的表達載體進行驗證，電泳結果見圖1。由圖1可知，經XhoⅠ及NotⅠ雙酶切后，在750～1 000 bp附近出現了1個條帶(E1)，與目的基因(813 bp)大小相符；使用BglⅡ對質粒線性化后出現了預期的2個片段(E2)，其中，10 kb附近為含有目的基因的片段，3 kb附近為含有抗性基因的片段。雙末端測序結果也確認目的基因被正確構建至表達載體中。使用SDS-PAGE方法分析目標蛋白(記為BCCSN)的表達情況，結果顯示，在3.5×104附近出現了1個較明顯的蛋白條帶(P1)，稍大于該蛋白的預測值(2.99 ×104)(圖1(b))。Bradford法測定發酵上清中的粗蛋白質質量濃度為0.77 mg/mL。

圖1 重組質粒酶切產物及其蛋白表達產物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis map of recombinant plasmidrestriction enzyme hydrolysates (a) andprotein expression products (b)

在本研究之前，已有多篇針對環狀芽胞桿菌MH-K1殼聚糖酶的相關報道。Yabuki等[17]最先對該酶進行純化及鑒定，確定該酶分子量約為3.0×104；Saito等[14]對該酶的晶體結構進行解析，確定該酶水解特定糖苷鍵類型的結構基礎；Fukamizo等[18]確定該酶蛋白序列中第218位的賴氨酸為底物結合關鍵氨基酸；Kouzai等[19]將該酶的基因導入水稻基因組中，證實其可增強水稻對稻瘟病的抵抗能力；Tomita等[20]

利用千葉短芽胞桿菌表達了該酶，并對其體外抗真菌活性進行了研究，但都沒有研究該酶水解產物的組成及結構。

2.2 水解產物組成及結構特征分析

使用UPLC-QTOF MS對水解產物進行檢測及分析，結果見圖2。由圖2可知，水解產物已被一定程度分離。選取其中的12個典型峰(A～L)，利用對應的質譜信息，在這些峰中一共找到37個較為明顯的潛在殼寡糖組分，結果見圖3。由圖3可知，這些潛在殼寡糖組分的聚合度為2～20，并根據不同的脫乙酰度將這些殼寡糖的分析結果總結于表1。

由圖2～3及表1結果可知：殼寡糖根據其中含有的氨基葡萄糖的數量由少至多出峰，使用的色譜柱基本能將不同氨基葡萄糖含量的殼寡糖組分分離開來；當相同氨基葡萄糖含量下出現不同數量的N-乙酰氨基葡萄糖時，該色譜柱難以對其有效分離。

結合全基因合成及密碼子優化，利用畢赤酵母分泌表達系統，可以快速獲得高活性的殼聚糖酶。液質分析結果顯示，利用該酶水解低脫乙酰度殼聚糖，可以獲得多種殼寡糖組分。與使用傳統的高脫乙酰度殼聚糖底物相比，改用低脫乙酰度底物獲得的產物殼寡糖組分更加多樣。

2.3 水解產物結構特征分析

為獲得殼聚糖酶對底物的位點識別特性及產物的結構特征，進一步使用1H NMR及13C NMR對水解產物進行鑒定，結果見圖4。由圖4可知：水解產物的還原末端主要由氨基葡萄糖組成(圖4(a))，而非還原末端則同時含有氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖(圖4(b))。上述結果說明該酶可同時水解糖苷鍵GlcN-GlcN及GlcN-GlcNAc，與Ⅲ型殼聚糖酶底物識別特性相符。

圖2 BCCSN酶解產物總離子流圖(TIC)Fig.2 TIC of BCCSN hydrolysis products

圖3 BCCSN酶解產物質譜Fig.3 Mass spectrogram of BCCSN hydrolysis products

序號保留時間/min實測m/z理論m/z推測組成A110.27341.4341.1[D2+H]+B112.28544.6544.2[D2A1+H]+C116.10502.5502.2[D3+H]+D117.40705.8705.3[D3A1+H]+E118.69909.0908.4[D3A2+H]+F121.76866.9866.4[D4A1+H]+F221.761 070.11 069.4[D4A2+H]+G122.99637.2636.8[D4A3+2H]2+H125.16514.6514.2[D5A1+2H]2+H225.16616.2615.8[D5A2+2H]2+H325.16717.8717.3[D5A3+2H]2+H425.16819.4818.8[D5A4+2H]2+I127.56696.8696.3[D6A2+2H]2+I227.56798.3797.8[D6A3+2H]2+I327.56900.0899.4[D6A4+2H]2+I427.561 001.61 000.9[D6A5+2H]2+I527.561 103.21 102.4[D6A6+2H]2+J130.24878.9878.4[D7A3+2H]2+J230.24980.5979.9[D7A4+2H]2+J330.241 082.21 081.4[D7A5+2H]2+J430.241 183.81 183.0[D7A6+2H]2+J530.241 285.31 284.5[D7A7+2H]2+K131.69707.7707.3[D8A4+3H]3+K231.69775.5775.0[D8A5+3H]3+K331.69843.2842.7[D8A6+3H]3+K431.69911.0910.4[D8A7+3H]3+K531.69978.7978.1[D8A8+3H]3+L132.87761.5761.0[D9A4+3H]3+L232.87829.2828.7[D9A5+3H]3+L332.87897.0896.4[D9A6+3H]3+L432.87964.7964.1[D9A7+3H]3+L532.871 032.41 031.8[D9A8+3H]3+L632.87950.7950.1[D10A6+3H]3+L732.871 018.41 017.7[D10A7+3H]3+L832.871 086.21 085.4[D10A8+3H]3+L932.871 153.91 153.1[D10A9+3H]3+L1032.871 221.61 220.8[D10A10+3H]3+

注：D代表氨基葡萄糖，A代表N-乙酰氨基葡萄糖，隨后的數字代表對應單糖的數量。

圖4 酶解產物1H NMR(a)及13C NMR(b)分析Fig.4 1H NMR (a) and 13C NMR (b) spectra of hydrolysis products

與動植物的特定受體結合并激活免疫等下游信號通路，是殼寡糖發揮生物活性的重要方式。研究發現，在動植物細胞中存在多種可識別殼寡糖鏈上N-乙酰氨基葡萄糖的特異性受體[21-27]。這些受體是否可以與低脫乙酰度的復雜結構殼寡糖結合以及何種結構殼寡糖可以激發最大的生物學活性等問題都缺乏系統研究。我們將進一步對特定結構殼寡糖進行制備及分離，以期為其結構與功能研究及新型殼寡糖產品開發提供前提及參考。

3 結論

利用畢赤酵母分泌表達環狀芽胞桿菌殼聚糖酶并使用該酶水解制備了低脫乙酰度殼寡糖。組分及結構分析結果顯示，這些殼寡糖的聚合度為2～20，可以獲得不同脫乙酰度的組分，寡糖鏈的還原末端主要由氨基葡萄糖組成，非還原端同時含有氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖。與傳統殼寡糖相比，本研究制備的殼寡糖組分更加復雜多樣，可能具有更高或者新的生物活性。