多孔整體柱固定化酶研究進(jìn)展

陳佩佩，龔林軍，呂永琴

(北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過程重點(diǎn)實驗室，北京 100029)

酶作為一種生物催化劑，與無機(jī)催化劑相比具有高效性、專一性和溫和性等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)催化中具有廣泛的應(yīng)用。但游離酶穩(wěn)定性差、不能重復(fù)使用，通常需要對其進(jìn)行固定化。與游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性高、易于分離回收、可重復(fù)使用以及操作工藝簡便且可控等一系列優(yōu)點(diǎn)。

固定化酶的性能主要取決于固定化方法和所使用的載體材料，二者能直接影響固定化酶的催化活性。理想的固定化酶載體需要具有以下特點(diǎn)：較高的穩(wěn)定性、良好的生物相容性、大的比表面積、傳質(zhì)性能好、易于功能化修飾和成本較低等[1-2]。近年來，研究者開發(fā)了很多新的固定化酶載體，但大多停留在實驗室的小試階段，難以應(yīng)用于工業(yè)催化放大應(yīng)用。

整體柱(monolithic column)，又稱為連續(xù)床，是由單體、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑的混合溶液在色譜柱內(nèi)通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)聚合得到的整體、連續(xù)的柱體。相對于常規(guī)填充柱，具有制備簡單、易于改性、滲透性好、柱壓低和傳質(zhì)速度快等優(yōu)點(diǎn)。20世紀(jì)50年代，諾貝爾獎獲得者Synge課題組首次提出了類似整體柱結(jié)構(gòu)的介質(zhì)[3]。1967年，Kubín等[4]用高度溶脹的聚2-羥乙基甲基丙烯酸制備了整體柱并用于蛋白質(zhì)的分離，但由于柱體溶脹、耐受壓力低，一直沒有引起人們的注意。直到1989年，Hjertén等[5]用高度交聯(lián)的丙烯酰胺成功制備了軟膠整體柱并應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離，整體柱技術(shù)才日益受到人們的重視。其后Svec等[6]和Ishizuka等[7]用聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯制備了高硬度有機(jī)聚合物整體柱。整體柱技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注，并被譽(yù)為第四代生物色譜固定相，廣泛應(yīng)用于色譜分離、固相萃取、分析檢測、氣體儲存和生物催化等領(lǐng)域。

多孔整體柱作為固定化酶的載體，其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在于大的貫穿孔道和良好的通透性，區(qū)別于傳統(tǒng)固定化酶載體的擴(kuò)散傳質(zhì)，整體柱可以為底物和產(chǎn)物提供快速的對流傳質(zhì)性能，從而大大提高酶催化的速率和效率。同時，整體柱的“柱體”形式可以實現(xiàn)連續(xù)可控酶催化反應(yīng)，產(chǎn)物易于分離，有利于實現(xiàn)工業(yè)放大。

根據(jù)整體柱骨架結(jié)構(gòu)的材質(zhì)不同，可將整體柱分成無機(jī)整體柱、有機(jī)聚合物整體柱、雜化整體柱(有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱)和納米材料整體柱。本文中，筆者將主要從硅膠整體柱、有機(jī)高聚物整體柱、有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱和納米材料整體柱4個方面介紹近年來整體柱在固定化酶方向的研究進(jìn)展。

1 硅膠整體柱固定化酶

硅膠整體柱是以硅膠為基質(zhì)的無機(jī)整體柱，與有機(jī)聚合物整體柱相比，具有理想的力學(xué)強(qiáng)度和比表面積大的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是化學(xué)穩(wěn)定性不高、適用的pH范圍較小。

硅膠整體柱除了以毛細(xì)管和不銹鋼柱為模具外，也可在微流控芯片的微通道內(nèi)合成。He等[12]在微流控芯片里制備了聚乙烯亞胺修飾的硅膠整體柱(圖1)，通過靜電吸附作用對乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶進(jìn)行共固定化，利用電化學(xué)方法檢測了馬拉氧磷、毒扁豆堿和滅多蟲，檢測限分別達(dá)到0.5、0.2和1.0 μmol/L。在微流控芯片微通道內(nèi)制備硅膠整體柱的難點(diǎn)之一是整體柱材料與通道表面的結(jié)合力差，這會引起整體柱的收縮和脫落。為解決這一問題，Yesil-Celiktas等[13]選用四乙氧基硅烷(TEOS)和乙二醇改性硅烷(EGMS)為前體，同時加入聚氧化乙烯(PEO)，大大降低了硅膠整體柱的收縮，保證了整體柱的多孔結(jié)構(gòu)，以此對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和纖維素酶進(jìn)行固載，最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)28.8%。Pirozzi等[14]通過對四甲氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷和N-丙基三甲氧基硅烷3種硅烷偶聯(lián)劑前體的配比進(jìn)行優(yōu)化，成功解決了整體柱材料與芯片通道表面結(jié)合力差的問題，同時通過增加整體柱的疏水性提高了酶的活性。

(a)整體柱通道(寬600 μm,深50 μm,長20 mm)；(b)電化學(xué)檢測通道(寬1.5 mm,深50 μm,長20 mm)；(c)連接通道(寬100 μm,深50 μm,長5 mm)；(d)入口(直徑1.5 mm，連接塑料管的直徑0.5 mm)；(e)出口(直徑1.5 mm)；(f)工作電極(WE,鉑圓盤,直徑0.5 mm)；(g)鉑電極CE(直徑1 mm)；(h)參考電極RE(Ag/AgCl，直徑1 mm)圖1 微流控裝置示意[12]Fig.1 Schematic of the micro-fluidic device[12]

多酶的共固定化是酶工程領(lǐng)域的重要研究課題，底物通道效應(yīng)[15]是多酶催化需要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題，即前一個酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物直接進(jìn)入到下一個酶的活性中心作為底物進(jìn)行催化反應(yīng)，而不是擴(kuò)散進(jìn)入反應(yīng)微環(huán)境中[2]。因此，多酶共固定化需要實現(xiàn)每個酶的定向有序固定化。Yin等[16]利用硅膠整體柱成功實現(xiàn)了苯甲酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和堿性磷酸酶的有序固定化，設(shè)計了三酶酶聯(lián)微反應(yīng)器(圖2)，在10 min內(nèi)可將99.5%的基因組DNA酶解成單核苷酸。與HPLC-MS聯(lián)用，從膀胱癌細(xì)胞(T24)的基因組DNA中成功檢測到表觀遺傳5-甲基胞嘧啶的主要氧化產(chǎn)物5-羥甲基胞嘧啶。

圖2 硅膠整體柱有序固載苯甲酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和堿性磷酸酶的三酶酶聯(lián)微反應(yīng)器的設(shè)計合成[16]Fig.2 Schematic diagram of design and synthesis of athree-enzyme-linked microreactor with orderlyimmobilized formate,snake venom phospho-diesterase and alkaline phosphatase[16]

在基于鳥槍法的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)酶解非常重要，整體柱固載酶在保證高效酶催化的同時，有利于減少酶的自身降解和交叉感染，并可以實現(xiàn)和分離鑒定系統(tǒng)的聯(lián)用。Rivera等[17]合成了硅膠和鈦整體柱，通過包覆一層生物仿生聚多巴胺膜，實現(xiàn)對胰蛋白酶的固定化，并與質(zhì)譜聯(lián)用，對蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析。Stanley課題組的Foo等[18]利用該類型的胰蛋白酶微反應(yīng)器結(jié)合高效液相-電噴霧-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)分析了馬血漿中重組人紅細(xì)胞生成素的酶解和去糖基化反應(yīng)過程。

除以上應(yīng)用外，硅膠整體柱還被用于蛇毒磷酸二酯酶、大豆過氧化物酶、轉(zhuǎn)氨酶和青霉素G酰化酶等多種酶的固定化，并將固定化酶應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域。

2 有機(jī)聚合物整體柱固定化酶

有機(jī)聚合物整體柱的制備是將單體、致孔劑和引發(fā)劑的混合溶液注入空模具內(nèi)，經(jīng)熱、光或γ線引發(fā)，在模具內(nèi)發(fā)生聚合形成整體柱，聚合完成后用合適的溶劑除去柱體內(nèi)的致孔劑和殘留的單體，其主要特點(diǎn)是制備過程簡單，滲透性和孔徑可通過調(diào)整致孔劑的配比來改變，pH使用范圍寬。此外，可供選擇的單體類型非常豐富，種類上基本不受限制，可根據(jù)不同的需要選用相應(yīng)的有機(jī)功能單體，還可在基質(zhì)的表面進(jìn)一步修飾或衍生，以滿足不同的需求[19]。

Xie等[20]首先將有機(jī)聚合物整體柱應(yīng)用于酶的固定化，他們利用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)作為功能單體合成有機(jī)聚合物整體柱，通過環(huán)氧基團(tuán)與乙二胺反應(yīng)鍵合氨基，進(jìn)一步利用戊二醛交聯(lián)實現(xiàn)胰蛋白酶的共價固定化。由于整體柱快速的對流傳質(zhì)性能，胰蛋白酶生物微反應(yīng)器的催化反應(yīng)速率是游離酶的300倍，在88 s內(nèi)即可實現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速酶解[21]。Ozoner等[22]也利用戊二醛交聯(lián)的方法實現(xiàn)了辣根過氧化物酶的固載，對酚類物質(zhì)的檢測限為1～250 μmol/L。除戊二醛交聯(lián)外，也可通過靜電吸附作用或金屬螯合作用實現(xiàn)酶的固定化，例如，可選用帶氨基的功能單體(如甲基丙烯酸氨基乙酯)合成整體柱，通過氨基對酶的靜電吸附作用實現(xiàn)酶的固載[23]。同時，可利用聚乙烯亞胺(PEI)修飾聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱，之后吸附Cu2+，通過金屬離子對酶的配位作用固定化酶[24]。后來很多課題組也將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱用于脂肪酶、胰凝乳蛋白酶、核糖核酸酶A、糖基肽酶和乙酰膽堿酯酶的固載，成功實現(xiàn)了藥物的手性拆分、核苷酸降解、糖基化分析和抑制劑的篩選。

乙烯基吖內(nèi)酯是另一種易衍生的功能單體，其吖內(nèi)酯基團(tuán)在常溫下可與酶的氨基反應(yīng)，從而實現(xiàn)酶在溫和條件下的共價固載。Xie等[20]首次提出利用乙烯基吖內(nèi)酯和丙烯酰胺作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)作為交聯(lián)劑合成整體柱，通過吖內(nèi)酯基團(tuán)的開環(huán)反應(yīng)對胰蛋白酶進(jìn)行固定化。結(jié)合甲基丙烯酸縮水甘油酯和乙烯基吖內(nèi)酯2種功能單體，該課題組同時開發(fā)了新的固定化酶工藝[25]，首先合成聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱，在堿性條件下與甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)反應(yīng)，再通過光引發(fā)接枝乙烯基吖內(nèi)酯。該工藝一方面在整體柱上引入了HEMA，增加了聚合物的親水性，降低了酶解過程中底物蛋白質(zhì)和產(chǎn)物多肽的非特異性吸附；另一方面，光引發(fā)接枝改性大大提高了吖內(nèi)酯的鍵合量，從而增大了酶的固載量。也可利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺為功能單體制備整體柱，通過琥珀酰亞胺與酶的氨基的共價結(jié)合，實現(xiàn)酶的固載[23]。

除通過自由基聚合反應(yīng)外，有機(jī)聚合物整體柱也可通過相分離技術(shù)合成。Sun等[26]利用非溶劑致相分離法制備了聚乙烯醇整體柱，比表面積高達(dá)102 m2/g，通過鍵合聚乙烯亞胺(PEI)和戊二醛，分別通過靜電吸附和共價結(jié)合對脂肪酶和辣根過氧化物酶進(jìn)行了固載。Uyama等[27]通過熱致相分離合成了聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱，通過EDC/NHS共價偶聯(lián)或醛基交聯(lián)實現(xiàn)了胃蛋白酶的固載。

尋求高效的化學(xué)反應(yīng)是提高酶固載率的有效手段。Kolb等[28]提出的點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)具有產(chǎn)率高、副產(chǎn)物無害、反應(yīng)立體選擇性高、反應(yīng)條件簡單、原料和反應(yīng)試劑易得、合成反應(yīng)快速、可在水相合成、產(chǎn)物對氧氣和水不敏感、符合原子經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)點(diǎn)。目前常用的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)主要包括銅催化疊氮化炔環(huán)加成(CuAAC)反應(yīng)和硫醇-烯(thiol-ene)點(diǎn)擊反應(yīng)。?elebi等[29]將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯整體柱與疊氮化鈉反應(yīng)鍵合疊氮基團(tuán)，對α-胰凝乳蛋白酶修飾鍵合炔鍵，利用CuAAC點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實現(xiàn)了α-胰凝乳蛋白酶的固載。Wu等[30]分別合成了疊氮配基和炔鍵配基的整體柱，分別對鍵合炔鍵合疊氮基團(tuán)的辣根過氧化物酶進(jìn)行了固載。與Cu(I)催化點(diǎn)擊化學(xué)法相比，硫醇-烯(thiol-ene)點(diǎn)擊反應(yīng)無需使用金屬銅作催化劑，具有良好的應(yīng)用前景。Lafleur等[31]首次利用硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)在微流控芯片微通道內(nèi)合成了乳液模板化的整體柱，成功實現(xiàn)了半乳糖氧化酶和糖基肽酶的固載(圖3)。同時，其他研究者利用相同的方法構(gòu)建整體柱，對胃蛋白酶進(jìn)行固定化，與超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)聯(lián)用，對酶解后的多肽進(jìn)行了高效肽譜分析[32]。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)反應(yīng)是以有機(jī)鹵化物為引發(fā)劑、過渡金屬配合物為鹵原子載體，通過氧化還原反應(yīng)，在活性種與休眠種之間建立可逆的動態(tài)平衡，從而實現(xiàn)對聚合物的可控合成。Li等[33]利用ATRP反應(yīng)合成了聚乙二醇二甲基丙烯酸整體柱，同時利用ATRP反應(yīng)在整體柱上接枝了聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯，大大增加了環(huán)氧基團(tuán)的含量，提高了胰蛋白酶的固載量，在50 s內(nèi)可實現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速酶解，反應(yīng)速率是游離酶的900倍。

圖3 硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)和ASA連接構(gòu)建肽-N-糖苷酶F固載酶生物微反應(yīng)器實現(xiàn)核糖核酸酶B的去糖基化[31]Fig.3 Deglycosylation of RNase B on the enzymaticmicroreactor featuring PNG ase F immobilizedvia thiol-ene click chemistry and ASA linkage[31]

固定化酶在反復(fù)多次使用后會失活，為降低成本，載體的再生利用至關(guān)重要。對此，Xiong等[34]通過光引發(fā)自由基聚合反應(yīng)在玻璃微芯片內(nèi)合成了多孔的溫度敏感性聚(N-異丙基丙烯酰胺)整體柱，當(dāng)溫度高于該聚合物的低臨界溶液溫度(LCST)，聚合物發(fā)生收縮并呈疏水性，葡萄糖氧化酶(GOx)通過疏水作用被吸附固載到整體柱上；相反，當(dāng)溫度小于LCST，聚合物發(fā)生溶脹并呈親水性，固載的GOx被釋放。因此，通過對外界溫度的控制可實現(xiàn)酶的可控固載和釋放，從而實現(xiàn)載體的再生利用。研究者將整體柱固載酶芯片與碳纖維微電極聯(lián)用，通過電化學(xué)法檢測葡萄糖濃度，檢測限為0.05～5 mmol/L。

3 有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱固定化酶

有機(jī)聚合物整體柱的優(yōu)點(diǎn)是具有大的貫穿孔道，在酶催化過程中有利于為底物和產(chǎn)物提供快速的對流傳質(zhì)性能，同時具有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，但缺點(diǎn)是比表面積較小、酶的負(fù)載量低。無機(jī)整體柱的優(yōu)點(diǎn)是比表面積大，酶的負(fù)載量高，缺點(diǎn)是化學(xué)穩(wěn)定性差。為充分結(jié)合二者的優(yōu)點(diǎn)，研究者提出了有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱的合成。

中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的張麗華和鄒漢法課題組對有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱固載酶微反應(yīng)器的設(shè)計進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，其主要的應(yīng)用是固載胰蛋白酶實現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。例如，Wu等[35]采用3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷為功能單體(GLYMO)、硅酸乙酯(TEOS)為交聯(lián)劑制備整體柱，對環(huán)氧基團(tuán)水解后獲得鄰二醇，通過鄰二醇與氨基的反應(yīng)實現(xiàn)胰蛋白酶的固載，該固載酶微反應(yīng)器在47 s內(nèi)完成對牛血清蛋白的酶解，多肽片段覆蓋率為35%。Ma等[36]選用四乙氧基硅烷水解溶膠、亞氨基二乙酸、3-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷合成雜化整體柱，Cu2+活化整體柱后，通過金屬螯合作用對胰蛋白酶進(jìn)行固載，在150 s內(nèi)可實現(xiàn)對5 μg小鼠肝臟提取物的高效酶解，同時利用金屬螯合作用的可逆性實現(xiàn)了整體柱載體的再生利用。Yuan等[37]通過四甲氧基硅烷和乙烯基三甲氧基硅烷的縮聚反應(yīng)合成硅膠整體柱，再以甲基丙烯酸為功能單體、過硫酸銨為交聯(lián)劑在硅膠整體柱上原位聚合制備雜化整體柱，利用碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)反應(yīng)對整體柱修飾鍵合聚乙烯亞胺，再進(jìn)一步共價固載胰蛋白酶。該固載酶反應(yīng)器與二維HPLC-MS/MS聯(lián)用對低轉(zhuǎn)移率的肝癌細(xì)胞蛋白萃取物進(jìn)行酶解和蛋白組學(xué)分析，可識別檢測3 000種蛋白質(zhì)。Chen等[38]采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和正硅酸甲酯合成整體柱，將胰蛋白酶的二硫鍵還原為巰基，利用整體柱表面雙鍵和巰基的“thiol-ene”點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實現(xiàn)酶的固載，反復(fù)使用100次后，殘余酶活仍為87.5%。

除對胰蛋白酶進(jìn)行固載外，Zhou等[39]利用雙[3-(三乙氧基硅烷)丙基]硫代氨基甲酸為功能單體，與硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)合成了層狀有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱，對辣根過氧化物酶(HRP)的固載量為126 mg/g，催化活性是游離酶的3倍。

4 納米材料與整體柱相結(jié)合固定化酶

多孔整體柱雖然能為酶和底物提供良好的對流傳質(zhì)性能，提高酶解反應(yīng)速率，但是使用過程中仍然存在兩個問題：一是整體柱由于具有連續(xù)的貫穿大孔，其比表面積較小，因此酶的固載量較低；二是傳統(tǒng)的固載酶方法存在一定的弊端，不利于提高酶的穩(wěn)定性和使用壽命。納米材料由于其獨(dú)特的小粒徑效應(yīng)、表面效應(yīng)和界面效應(yīng)，作為載體用于酶的固定化有利于保持酶的活性和穩(wěn)定性，大大提高酶的固載量和催化效率[40]。然而，納米顆粒尺寸太小、吸附性太強(qiáng)、極易團(tuán)聚，單獨(dú)作為載體固定化酶時，不利用后續(xù)與產(chǎn)物的分離。若將整體柱與納米材料相結(jié)合，可以解決傳統(tǒng)固載酶生物反應(yīng)器傳質(zhì)速度慢、固載量低和催化效率差等問題，大大提高固載酶的穩(wěn)定性、使用壽命、催化速率和效率。

由于納米金具有良好的分子識別特性和生物相容性，筆者在毛細(xì)管內(nèi)成功構(gòu)建了高密度納米金多孔聚合物整體柱[41]。合成聚甲基丙烯酸縮水甘油酯毛細(xì)管整體柱骨架材料，其環(huán)氧基團(tuán)與胱胺反應(yīng)，再通過三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(TCEP)打開二硫鍵獲得巰基，利用巰基與納米金的親和作用，在整體柱上成功地鍵合了一層排列規(guī)則、致密、連續(xù)的納米金(圖4)，鍵合40 nm納米金的鍵合量高達(dá)60%，為目前所有文獻(xiàn)報道中的最大值。以納米金作為中間配體，通過Au-S可逆親和作用固載脂肪酶(圖5)，成功催化了玉米油和大豆油的酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油。對催化反應(yīng)動力學(xué)的研究表明，該納米金整體柱固載酶微反應(yīng)器的最大反應(yīng)速率是游離酶催化的1 000倍。該固載酶微反應(yīng)器具有良好的使用壽命，連續(xù)催化1 760個反應(yīng)器體積后，固載酶的殘余酶活仍為80%。同時，納米金與酶的親和作用力可逆，作用條件溫和，固載酶連續(xù)多次使用后失活，利用巰基乙醇破壞納米金與酶的親和作用，可以洗脫失活酶，重新固載新酶后可以再生利用，再生后的固定酶催化性能與新合成的催化性能相當(dāng)。

圖4 納米金整體柱的掃描電子顯微鏡照片[41]Fig.4 Scanning electron micrograph of a nanogoldmonolithic column[41]

圖5 納米金整體柱固載酶微反應(yīng)器的設(shè)計過程[41]Fig.5 Design process for a nanogold monolithiccolumn-loaded enzyme microreactor[41]

除納米金外，Shangguan等[42]在合成有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱時加入了SBA-15納米顆粒，增大了整體柱的比表面積，分別通過戊二醛交聯(lián)和金屬螯合作用對酶進(jìn)行固載，構(gòu)建了胰蛋白酶微反應(yīng)器和胰蛋白酶/糜蛋白酶雙酶反應(yīng)器，與單酶反應(yīng)器相比，雙酶反應(yīng)器可鑒定的多肽片段數(shù)目增加1倍，提高了大鼠肝臟膜蛋白的總體功能分析。Xu等[43]研發(fā)了一種新的介孔二氧化硅納米顆粒，與甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)原位共聚制備整體柱，對胃蛋白酶進(jìn)行固載，實現(xiàn)了藥物的手性拆分，研究發(fā)現(xiàn)，硅納米顆粒的引入大大增加了結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量，增大了酶的固載量，提高了手性拆分的效率。Hong等[44]提出了氧化石墨烯硅膠整體柱固載胃蛋白酶，研究了氨水、乙二胺和聚乙烯亞胺等不同修飾方法和間臂分子對氧化石墨烯負(fù)載量的影響。

5 結(jié)論與展望

整體柱具有制備簡單、力學(xué)強(qiáng)度高和通透性好等獨(dú)特優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于酶的固定化。本文中，筆者總結(jié)了硅膠整體柱、有機(jī)聚合物整體柱、有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱和納米材料整體柱固載酶的構(gòu)建方法、應(yīng)用及各自的優(yōu)缺點(diǎn)，為提高酶催化的性能提供了新的思路和方法。在今后的研究中，仍然需要開發(fā)簡單易控的整體柱制備技術(shù)，或?qū)ΜF(xiàn)有制備技術(shù)的工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化，改善整體柱形貌和孔道的均勻性，提高整體柱的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，繼續(xù)發(fā)展新型高效的固定化酶方法，實現(xiàn)整體柱固載酶的工業(yè)化應(yīng)用。