原子力顯微鏡在測定顆粒與細胞相互作用中的應用

宋 翠，張 瀟，魏 煒，馬光輝

(1. 中國科學院 過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190；2.中國科學院大學，北京 100049)

近年來，納微顆粒憑借其特殊的尺寸效應和物理化學性質，在醫藥、物理、光學和電學等領域應用越來越廣泛，尤其是在生物醫藥領域，納微顆粒被廣泛用作緩釋制劑、靶向制劑和疫苗佐劑等[1]。顆粒在體內輸運過程中，其與體內細胞接觸并相互作用，相關研究表明這種相互作用會對細胞的生長、遷移和細胞因子的分泌等生理過程產生重要影響，從而調控顆粒攜帶的生物藥劑的藥效發揮、靶向性以及顆粒的佐劑免疫效果等[2]。因此，研究顆粒與細胞的相互作用對于促進納微顆粒在生物醫藥領域的應用有著重要的意義。

已有研究表明，顆粒與細胞的相互作用與顆粒的理化性質密切相關，顆粒的粒徑、表面性質、形狀等都會影響其與細胞的作用過程[3-4]，并且隨著微納米制造技術的發展，定向調控顆粒的理化性質成為可能[5]。為了系統深入地研究顆粒與細胞的相互作用，定量檢測作用過程的重要參數和闡明其微觀作用機制，近年來發明和改進了許多先進的檢測設備和技術，例如光鑷[6]、磁鑷[7]和原子力顯微鏡[8]等。其中，原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)由于具有高靈敏度(皮牛級)、高分辨率(納米級)以及可在生理環境中進行實時檢測等優勢備受關注。雖然有研究報道原子力顯微鏡在生物醫藥中的應用[9-10]，但對于原子力顯微鏡檢測顆粒與細胞相互作用的文獻綜述卻很少，因此，本文中筆者系統闡述AFM在研究顆粒與細胞相互作用的原理及應用，以期為后續的研究提供參考。

1 原子力顯微鏡的基本介紹

1.1 力學測量原理

自從1986年Binnig等[8]發明原子力顯微鏡以來，AFM 已成為獲取材料表面原子級分辨率圖片和檢測力學性能的有力工具。AFM可以在真空、大氣或者溶液環境中操作，檢測對象可以是導體、半導體或者絕緣體，克服了之前掃描隧道顯微鏡只能對導電樣品表面進行檢測的局限。其工作原理如下：將一個彈性微懸臂的一端固定，另一端有一微小的針尖與樣品表面相互作用,使懸臂發生位移，懸臂的位移通過激光和四象限檢測器來進行記錄監控，在掃描過程中，懸臂垂直方向的位移被轉換成樣品表面形貌，同時通過測定懸臂的彈性系數也可獲得力與位移的曲線，如圖1所示，包括靠近曲線和遠離曲線。樣品的力學性質(如黏附力、楊氏模量等)可以從力曲線中獲得。黏附力可以直接從遠離曲線中讀取，楊氏模量需要先把力曲線轉換為力與壓痕深度的曲線，然后再選擇合適的理論模型(Hertz模型或Sneddon 模型)來擬合計算[11]。

圖1 AFM檢測顆粒與細胞之間的相互作用力曲線Fig.1 Interaction forces between particle and cellmeasured by AFM

1.2 探針

探針是AFM最核心最重要的元件，它一般包含兩個部分：懸臂和針尖。探針懸臂的材質通常是Si或者Si3N4，形狀有矩形或V字形。為了提高反射率，懸臂的背面會鍍有一層薄薄的金屬層(一般為Au)，這對于AFM在液體中進行檢測是非常必要的，因為在液體中Si3N4的反射率會明顯下降。懸臂的核心參數是其彈性系數，在進行力曲線測量時需要首先對其標定和校正，目前最常用的校正方法是Thermal Tuning法[12-13]和Sader法[14-15]。

探針針尖主要由Si或Si3N4材質制造，但是為了滿足特殊的應用需求，鉆石、碳或者礦物單晶等[16-17]也可用做探針針尖，形狀通常是三角錐形，半徑分布在十到幾十納米。

1.3 膠體探針

通過對探針表面修飾化學分子或目標蛋白，AFM可以檢測不同分子之間或分子與細胞之間的相互作用[18-19]。為了進一步測量顆粒與細胞的相互作用，需要將微納米級的顆粒黏附在探針懸臂末端，將其作為探針針尖與細胞接觸來進行測量，這種探針被稱為膠體探針[20](圖1)。與傳統探針相比，膠體探針有以下優點：首先，顆粒與細胞接觸面的曲率半徑大，這增加了顆粒與細胞的接觸面積，減少了錐形探針對細胞局部應力過大的傷害；其次，接觸面積變大使得細胞局部的硬度波動變小，因此只需較少的實驗次數便可獲得更可靠的數據；最后，將膠體探針與細胞表面接觸的幾何形狀視為球形，細胞的楊氏模量就可以選用簡單的Hertz 模型直接擬合得到[11]，無需進行繁雜的公式推導，這極大地提高了數據處理效率。

膠體探針的出現為AFM的應用開拓了新的領域，研究者們進一步對膠體探針進行修飾[21-22]，從而進行一系列特定相互作用力大小和作用機制的研究。自從Ducker等[20]和 Butt 等[23]在1991年報道了膠體探針制備技術后，已經涌現出各種各樣的膠體探針的制備方法[24-25]。研究者們可以根據顆粒的性質、操作環境和特殊的設備要求等來選擇合適的方法進行膠體探針的制備。

1.4 樣品制備

AFM的樣品不需要染色、標記或噴涂，因此分子、細胞等生物樣品可以直接在生理環境中進行觀察。然而生物樣品的制備也是限制AFM在生物領域應用的主要原因，因為測量時需要保證生物樣品牢牢地固定在基底上以避免被探針刮走或者發生結構改變。對于活細胞，特別是哺乳動物細胞，它們具備良好的貼壁生長性能，不會輕易被探針干擾或移動，因此可以直接在培養皿中進行掃描。而對于懸浮細胞或者細菌，就需要在掃描時使用特殊的實驗方法將其固定，比如固定在濾膜膜孔中[26]，或者通過修飾基底表面將樣品固定[27]等。不管選擇何種樣品制備方法，在檢測時都要盡量選擇較小的力和合適的掃描模式以降低探針對樣品的影響。

1.5 力學測量技術的發展

隨著AFM的不斷創新和優化，其檢測模式和測量方法也不斷被優化。在AFM現有的測量方法中，已經實現了細胞的表面形貌信息和相關力學性能的同步測量，避免了之前對力曲線的后續手動擬合環節，極大地提高了測量效率。其中的一種技術是力體積成像技術(force volume imaging)[28-29]，這種技術可以對樣品選定范圍進行逐點力測定，并以圖像中相應像素點的明暗程度表示作用力的大小，從而直觀地反映出樣品表面的整體特征，避免了單點力測定的一些局限性，然而其線性分辨率較低，且掃描速度較慢，因此獲得一幅完整的表面圖需要很長的時間。最新開發的一種技術叫定量納米力學成像技術(peak force quantitative nanomechanical property mapping，PFQNM)[30-31]，該技術不僅易操作,而且可以在輕敲模式下快速地獲得高分辨率的樣品表面力學圖像，極大地提高了AFM力學測量的效率。

2 AFM測量顆粒與細胞相互作用在生物醫藥領域的應用

顆粒與細胞的相互作用會受到顆粒理化性質的影響，包括顆粒的大小、形狀、表面電荷和官能團等，利用顆粒制備技術,比如物理性質優化、化學修飾或者生物合成等,可以制備需要的顆粒,從而滿足其在生物醫藥領域的應用。利用AFM檢測顆粒與細胞之間的相互作用，獲得相應的力學性能，這些力學性能和體系中的生理現象相結合有助于解釋顆粒在生物醫藥領域應用，如藥物遞送、免疫響應和細胞力學等涉及深層次的作用機制，包括顆粒進入體內后，影響其作為藥物遞送系統靶向性、高效性的因素和對細胞毒性的影響；顆粒與免疫細胞相互作用從而介導炎癥反應的機制以及作為疫苗佐劑的免疫響應機制；顆粒與細胞相互作用對細胞結構以及力學性能的影響等。

2.1 藥物遞送

隨著生物技術的發展，越來越多的生物藥物得到發明和開發，例如，蛋白質、多肽、抗體和核酸等。然而生物藥物存在體內易降解、半衰期短、患者必須接受頻繁注射、血藥濃度波動大、藥效不理想或產生毒副作用等問題，特別是抗腫瘤藥物存在瘤內滲透困難和細胞攝取不足的難題，這些都會導致實際治療效果不佳。為了提高生物藥物的利用率、靶向性并減少毒副作用，研究者們進行了大量藥物遞送系統的研究工作[32-33]。藥物遞送最基本的原則是直接將藥物輸送到目標組織或細胞以獲得最好的治療效果和最小的毒性影響，而阻礙治療效果的原因主要是藥物遞送系統與各種生理和病理環境的復雜相互作用。生物納米技術的應用使得納微級顆粒的藥物遞送系統得以快速發展并備受關注[34-35]，這些載體可包裹靶向細胞或組織的表面受體的成分，并具有膜內外運輸的能力。

藥物遞送到指定位置時首先是載體顆粒與生物膜接觸發生相互作用，如果要將更多的藥物遞送到靶向細胞，那么載體與細胞膜之間強烈的相互作用可能會引起細胞膜的不穩定，從而產生細胞毒性。AFM成像能在時空尺度上對細胞膜接觸藥物分子、納米顆粒或藥物復合物后產生的結構變化和膜重組過程進行監測。Banaszak研究組的Hong等[36]、Leroueil等[37-38]利用AFM成像揭示了具有氨基末端的聚酰胺(PAMAM)聚合物與細胞膜相互作用對細胞膜的影響，研究發現，帶正電的PAMAM會引起細胞膜的無序排列，在磷脂雙分子層區域形成直徑約30 nm的孔，且會使膜變薄甚至發生膜擾動，而在這些無序排列的部位發現了藥物遞送系統的聚集，然而不帶電的顆粒卻不會產生這些變化。

通過膠體探針AFM，可以檢測影響藥物遞送系統與細胞作用的各種影響因素，比如細胞、顆粒的性質和生理環境等。Pyo等[39]利用AFM研究了不同的細胞及細胞培養密度對納米硅藥物遞送系統與細胞相互作用的影響，結果顯示不同的細胞培養密度以及細胞表面的褶皺形貌都會對相互作用產生影響。Shinto 等[22]利用膠體探針研究了不同條件下聚乳酸微球(PLLA)與小鼠黑色素瘤細胞的相互作用，研究表明，微球表面包裹了羥磷灰石(HAp)納米顆粒后，相較于光滑的PLLA顆粒，其與細胞的黏附力增大，并且在有血清的環境中比在無血清環境中黏附力也會增大，這可能是由于HAp/PLLA顆粒表面呈正電并會吸附較多血清中黏附蛋白的原因。Pyrgiotakis等[40]研究了功能化的納米顆粒CeO2和Fe2O3在不同的生理環境中與肺的上皮細胞之間的相互作用，結果表明，它們之間的相互作用力很大程度上依賴于生理環境，在生理液中蛋白冠的存在減弱了顆粒與細胞之間的相互作用，另外，這種作用也受顆粒大小和材質的影響。

上述研究表明：要減少藥物遞送系統對正常細胞的毒性并且提高對于靶向細胞的靶向效率，其理化性質以及所處的生理環境等都會產生重要的影響。因此，構建高效安全的藥物遞送系統，需要評價各種因素，從而進行篩選。傳統的篩選方法費時費力，而利用AFM測量藥物遞送系統與細胞之間的相互作用，通過測量黏附力，可以快速準確地評價各因素對相互作用的影響，這為設計和制備更加高效安全的藥物遞送系統提供了直觀準確的理論依據。

2.2 免疫響應

免疫反應可分為非特異性免疫反應和特異性免疫反應。非特異性免疫反應對抗原反應迅速，是人體的第一道防線[41]。特異性免疫反應，是通過免疫細胞的選擇和擴增來激活T細胞和B細胞，從而獲得永久性免疫記憶[42]。非特異性免疫可以協同和參與特異性免疫反應。顆粒可以作為佐劑或半抗原激活免疫反應[43]，當顆粒進入身體時，它們與免疫細胞的相互作用方式可能是多種多樣的[44]，它們可以與中性粒細胞、巨噬細胞和其他效應細胞作用從而引發炎癥反應，也可以與樹突細胞(DC 細胞)相互作用而被內吞噬從而發生抗原反應。而顆粒的物理化學性質會影響其與免疫細胞的相互作用和隨后的免疫反應，所以檢測顆粒與免疫細胞的相互作用對研究免疫反應、揭示免疫機制具有重要的意義。

為揭示顆粒激活免疫細胞，介導炎癥反應的機制,Ng等[45]利用AFM研究了尿酸鈉晶體與DC細胞膜的相互作用，結果發現，在沒有受體的情況下，晶體顆粒能直接作用于細胞膜上特別是膽固醇部分,從而激活DC細胞內SyK激酶介導的信號傳遞。為研究最原始的免疫細胞吞噬顆粒的作用機制，Mu等[46]使用AFM聯合熒光顯微鏡，通過AFM將聚苯乙烯顆粒置于DC細胞上與細胞接觸，實時記錄細胞膜上磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)和膜突蛋白的熒光圖像，結果發現，在沒有受體時，固體顆粒接觸細胞膜引起質膜變形，使得PIP2蛋白聚集，從而結合膜突蛋白，進一步激活SyK激酶并引起細胞的吞噬作用。

顆粒佐劑作為一種重要的疫苗佐劑，其免疫效應也備受關注，其中鋁佐劑被廣泛應用，但其免疫機制尚不明確。為揭示鋁佐劑的免疫作用機制，Flach等[47]將鋁佐劑粘于AFM探針上，并實時檢測鋁佐劑與樹突細胞的相互作用，結果發現，兩者之間有很強的作用力，但鋁佐劑一直停留在細胞膜上時并不會被吞噬，與鋁佐劑相互作用后的DC細胞隨后被激活。他們研究發現可能是由于細胞膜磷脂層結構的轉變激活了DC細胞，從而提出了一種關于鋁佐劑的新的免疫機制。

抗原提呈細胞(antigen-presenting cells,APCs)特別是DC 細胞的激活是引發機體免疫應答的第一關，DC 細胞表面表達多種受體，進入體內的抗原通過與受體識別、結合而激活免疫細胞是目前研究比較成熟的一種激活途徑。另外，免疫細胞也可以在無受體參與的情況下被顆粒激活，但其激活的機制與途徑等的相關研究卻很少。研究者們通過AFM檢測顆粒與免疫細胞之間的相互作用，為揭示無受體情況下顆粒激活APCs、介導炎癥反應以及細胞吞噬等免疫作用機制提供了一種新的研究思路和方法。

2.3 細胞力學

細胞力學主要研究活細胞的行為、力學性能以及它們與細胞功能的關系。組成細胞的結構包括細胞膜、細胞骨架、細胞器和細胞質，它們的力學和動態行為以及如何相互作用從而影響細胞的整體性質是細胞力學研究的重點[48]。研究表明，細胞對于外界刺激的力學響應對于細胞的行為有重要的影響，例如，細胞的遷移、擴增、分化和凋亡等[49]。顆粒技術的快速發展使得顆粒成為研究細胞力學的理想工具，因為顆粒能與細胞直接接觸，通過一定的方法可檢測顆粒是如何改變細胞硬度和力學性能的。AFM在檢測細胞力學方面有獨特的優勢，特別是膠體探針的應用使得AFM成為目前利用顆粒進行細胞力學性能測量尤其是細胞表面力學測量的主要工具。

利用膠體探針AFM，可檢測細胞骨架的力學性能，從而對肌動蛋白在調節細胞的黏彈性及力學行為上的作用進行研究。Watanabe-Nakayama等[50]用粘有玻璃小球的AFM 探針，第一次定量檢測了細胞對于循環拉伸和壓縮的響應，結果表明，由于細胞黏彈性，細胞張力開始增加然后在1 min內減少；超過幾分鐘后，這種松弛度會緩慢增加，張力的恢復在幾次往復施加力后逐漸消失；當細胞內的肌動蛋白被抑制后，張力的恢復也被抑制，表明這種行為是由肌動蛋白驅動的。利用膠體探針，還可比較細胞不同部分的力學性能，Babahosseini等[51]使用了粘有玻璃小球的探針比較了非浸潤性人乳腺細胞(MCF-10A)和浸潤性乳腺癌細胞(MDA-MB-231)內部區域的生物力學性能。他們把細胞從上到下分為三層結構：質膜和肌動蛋白層(上層)、胞質和細胞核層(中層)以及細胞核和整合素層(底層)，利用廣義麥克斯韋模型比較了2種細胞不同層的硬度，結果表明，無論哪種細胞越往下其硬度和黏性越大，并且發現非浸潤性細胞的硬度和黏性要比浸潤性細胞大。現在的AFM還可以通過聯合其他先進技術(如熒光成像技術等)來拓展它的應用[52-53]，這種集成多種功能的AFM可以實時檢測力作用時細胞的反應。例如Shi等[54]將AFM與熒光顯微鏡聯用，對牙周韌帶細胞進行了形貌微結構表征，并利用膠體探針對細胞施加一定的力，通過熒光顯微鏡實時觀察細胞受到力后其結構的變化與反應，最后發現該細胞具有很強的力纖維和楊氏模量，所以它能很好地抵消外力的影響。

細胞的黏彈性和力學性能也可作為疾病診斷的依據，比如癌癥、關節炎、骨質疏松癥和心血管病等[55]。Cross等[56]提取了肺、胰腺和乳腺癌細胞并用AFM對它們的硬度進行分析發現，癌細胞比良性的細胞都要軟，說明力學性能可以作為區別癌細胞與正常細胞的一個判斷依據。Nguyen等[57]通過使用微米級的球形探針，表征了良性人乳腺細胞MCF-10A和人乳腺癌上皮細胞(MCF-7)的黏彈性，結果發現，兩者有明顯的區別，MCF-7細胞比MCF-10A 細胞更軟，經過細胞松弛素處理的MCF-10A，由于細胞骨架排列被擾亂其松弛度會增加。這與Li等[58]對細胞MCF-7和MCF-10A的研究結果一致。

膠體探針AFM 在細胞力學領域取得了許多突破性的進展，通過AFM 可以檢測單個細胞和細胞膜等細胞組分的力學性能，得到包括細胞膜楊氏模量、細胞骨架和細胞核黏彈性等特征參數。利用AFM 研究力對細胞性質和功能的影響，是揭示組織、器官生物力學特性的基礎，也是進一步研究細胞內生物大分子力學性能的出發點。同時，有助于深入研究細胞的生理、病理行為，為疾病的快速診斷和鑒別提供了一種有效的技術手段。

3 展望

顆粒與細胞的相互作用因為具有重要的生理意義和廣泛的應用前景受到越來越多的重視，先進的顆粒制備技術提供了顆粒的多樣性，檢測技術的發展也使得結果更加準確可靠。AFM經過幾十年的發展，已成為表征和研究活細胞的主要工具之一，特別是在力學性能測量方面，憑借其獨特的檢測優勢，AFM成為了檢測顆粒與細胞相互作用的重要工具。但AFM也有待改善的地方：首先，由于實驗設備限制，現在每次實驗是通過一根探針對單一目標進行測量，為了提高效率，未來可以開發多探針并行系統。其次，目前AFM主要對顆粒與細胞膜表面的相互作用進行檢測，對于細胞內部的檢測還存在困難，這有望通過制造更加細長的探針比如納米針來實現[59]，這種探針可以在減少損傷細胞的情況下刺入細胞內部進行操作,從而對細胞核、細胞質等進行原位力學性質測量。為了更好地研究顆粒與細胞之間的相互作用，研究者們利用光鑷、磁鑷等技術直接通過激光或磁場操縱顆粒進行相互作用的研究，兩種技術能實現同時檢測多個顆粒并可在細胞內操縱顆粒，彌補了AFM 的不足，三種技術各有優勢，在研究時可以相互補充。

目前，將 AFM與其他的先進技術進行聯用，比如熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及單分子熒光顯微鏡等已經成為新的研究熱點，通過聯用可以在獲得力學性能數據的同時獲得熒光圖像等信息，直接觀察到力學性能對細胞行為及功能的影響等，當然現在的聯用技術還不太完善，未來還需要進行更多的探索工作。