基于肌紅蛋白的氧激活蛋白的理性設計

于 洋

(北京理工大學 化學與化工學院 生化工程系 合成生物系統研究所，北京 100081)

金屬蛋白是以含有金屬離子或者金屬配位化合物作為輔因子的蛋白質。在蛋白質組中，有超過1/3的蛋白質屬于金屬蛋白[1]。金屬蛋白催化了生命活動中的很多重要反應，包括水氧化、氧氣還原、固氮、CO2固定等。這些金屬酶的催化效率、選擇性等往往超過了小分子催化劑，同時具有酶催化固有的反應條件溫和、選擇性高的特點。由于這些優點，金屬酶，如P450單加氧酶、漆酶、裂解性多糖單加氧酶等，也廣泛應用在工業生物催化的領域[2-3]。

很多復雜的金屬酶，如光系統Ⅱ、細胞色素c氧化酶和固氮酶等分子量很大，大部分酶還是膜蛋白，這為酶蛋白的制備和應用帶來了困難[1]。同時，由于這些復雜金屬酶中含有多個金屬中心，不同金屬中心的光譜(紫外-可見光、電子順磁共振和Mossbauer等)重疊，使得活性中心之外的金屬中心往往會干擾針對活性中心的機制研究[4]。

為了克服天然金屬酶研究中存在的難于純化、產量低的問題，化學家通過合成小分子模型化合物，模擬蛋白尤其是金屬蛋白的活性中心進行研究，解析酶催化中的關鍵結構特征。然而，研究者越來越多地發現，蛋白質并非簡單作為金屬輔酶的容器和配體的提供者，而是通過對金屬中心的氫鍵等非共價相互作用，對金屬輔酶進行精細調控，以使其催化性質與功能匹配[1]。構建模型化合物無法完全重現金屬中心在蛋白質中的配位環境。

為了將模型化合物易于研究和蛋白質對活性中心精細調控的優勢結合，研究者們發展了理性設計構建人工酶的研究方法。通過使用分子量小、結構簡單、易于表達的骨架蛋白，模擬天然金屬酶的功能，可以大大簡化分離純化的工作量，更重要的是排除天然蛋白中多個輔酶、蛋白亞基的干擾。而蛋白質骨架又方便地提供了通過氨基酸殘基精細調控蛋白功能的手段。與小分子化合物相對應，這種在小蛋白骨架中實現復雜天然酶的結構、光譜或者功能特性而得到的突變體，通常稱為模型蛋白或者模型人工酶。

金屬酶參與的一大類反應涉及氧(O2或者H2O2)的激活[1]。其中，含血紅素的蛋白催化了多樣的反應(圖1)。由圖1可以發現，血紅素分子能以相對一致的配位環境，高效、高選擇性地結合O2或者H2O2，通過相似的中間體，實現對底物1，2或者4電子的氧化，從而催化不同反應。以相似的血紅素輔因子實現多樣的反應，說明了蛋白質對血紅素的性質有精細的調控；而反應中間體和途徑的相似性，為不同血紅素蛋白之間的相互轉換提供了可能。

圖1 不同血紅素酶通過相似的途徑活化O2，催化不同的反應Fig.1 Heme enzymes activate oxygen through similar routes,and catalyze diverse reactions

1 以肌紅蛋白為骨架蛋白的氧激活蛋白的理性設計

研究者是否可以基于對天然金屬酶的知識，在最簡單的血紅素蛋白中，通過理性設計，實現其他種類血紅素蛋白的催化活性?

在眾多含血紅素的蛋白質中，肌紅蛋白(myoglobin,Mb)是較簡單的一個，它的分子量約1.7×104，其結構中含1個血紅素分子，是人類最早解析結構的蛋白[5]。而且，它是1個結合O2的蛋白，功能簡單，研究也非常透徹。基于這些優勢，肌紅蛋白是模擬其他血紅素酶的最佳起點(圖2)[6]。

圖2 肌紅蛋白作為骨架蛋白，模擬多種血紅素蛋白的結構功能Fig.2 Many heme enzymes′ function can be realizedin artificial enzymes using myoglobinas scaffold protein

野生型肌紅蛋白具有一定的過氧化物酶(peroxidase)的活性[7]，但是其活性遠低于天然的過氧化物酶。在天然的過氧化物酶中，血紅素遠端口袋中組氨酸的Nε與Fe的距離是0.55～0.60 nm，而在肌紅蛋白中，第64位的組氨酸Nε與Fe的距離僅為0.44 nm。Matsui等[8]通過點突變的方法，系統改變了肌紅蛋白中的這一距離。其中，F43H/H64L Mb突變體比野生型的活性提高了11倍，而L29H/H64L的過氧化物酶活性反而降低。Guo等[9]和Dong等[10]在肌紅蛋白的遠端口袋中保留了原來的64H，引入了另1個組氨酸——L29H，得到的突變體過氧化物酶活性提高了3.7倍，而引入第3個組氨酸F43H不會進一步提高酶活。另一方面，如果移除64H，構建出底物通往血紅素中心的分子通道，同時構建出29H和43H，則L29H/F43H/H64A Mb突變體能表現出類似天然過氧化物酶的催化活性[11]。這些研究說明組氨酸在過氧化物酶催化中有重要作用，它在空間上的正確定位可以促進O—O鍵的異裂，提高過氧化物酶活性。

與過氧化物酶相比，過加氧酶(peroxygenase)和P450單加氧酶(P450 monooxygenase)活化H2O2形成的活性物種CompoundⅠ可以直接與底物反應，催化底物的加氧反應，這類反應常見于天然產物、藥物分子的合成中[2]。過加氧酶可以催化底物的直接加氧反應，與P450單加氧酶相比，它可以直接接受過氧化氫，而不需要還原劑或者還原蛋白的作用，因而更加受到工業催化領域研究者的青睞。野生型肌紅蛋白缺乏過加氧酶或P450單加氧酶的反應活性。Ohashi等[12]和Garner等[13]通過將肌紅蛋白中的血紅素替換為席夫堿(salen、salophen)-金屬配合物，令其有效催化不對稱環氧化及磺化氧化等反應，構建了人工酶。

在單加氧酶中，血紅素的遠端口袋中有1對常見的帶負電氨基酸和含羥基氨基酸，通過氫鍵與結合的O2作用，將電子“拉”離O2分子，促進O—O鍵的異裂[14-15]。O—O鍵的異裂產生的CompoundⅠ(FeIV=O radical物種)是一種強氧化劑，可以直接氧化底物。Yang等[16]通過在肌紅蛋白中引入V68D突變模擬P450單加氧酶中的帶負電氨基酸，使突變體催化磺化氧化反應的速率提高了1 600倍。在此基礎上，Pfister等[17]構建了肌紅蛋白F43W/H64D/V68I Mb突變體，通過F43W突變將底物吲哚環作為氨基酸側鏈固定在活性中心附近，以H2O2為氧化劑，直接觀察到了F43W側鏈的羥基化。這一人工酶的構建，也說明了負電氨基酸(64D)對于單加氧酶活性的重要調控作用。

氧化酶位于細胞呼吸鏈的末端，催化了O2還原為H2O的反應，其催化過程涉及O2的激活、O—O鍵的異裂、氧的完全還原等步驟(圖1)。氧化酶，如細胞色素c氧化酶(CcO)等催化了細胞內90%以上O2的還原，催化速率可以達到50～1 000 s-1[18-19]。它們在高效反應的同時維持了反應的選擇性，幾乎不產生具有細胞毒性的活性氧中間體(reactive oxygen species，ROS)。CcO作為1個分子量超過4.00×105的蛋白復合體，其O2的還原發生在由血紅素和銅離子(CuB)組成的雙核中心(圖3)。CcO的活性中心具有保守的結構特征，包括由近端組氨酸配位的血紅素分子，遠端口袋中3個組氨酸配位的CuB銅離子，指向血紅素的酪氨酸以及酪氨酸和與CuB配位的1個組氨酸形成的共價交聯。

(a)細胞色素c氧化酶的活性中心(PDB ID:1OCC)灰色圓球為銅離子；(b)F33Y-CuBMb(PDB ID:4FWX)和F33imiTyr-CuBMb(淺灰色，計算模擬結構)的比較圖3 天然和人工設計的氧化酶的活性中心結構[20]Fig.3 Active site structures of naturaland artificial oxidases[20]

以上從天然蛋白質生化研究和晶體結構中得到的活性中心結構特征指導了將肌紅蛋白理性設計為具有活性的氧化酶的研究。Sigman等[21]首先在肌紅蛋白中引入了L29H/F43H的突變，新引入的2個組氨酸加上原有的H64，形成了3個組氨酸的結構特征，紫外-可見光譜與晶體結構均證明這一突變體——CuBMb可以結合銅離子，形成CuB中心。進一步在CuBMb中引入酪氨酸(F33Y或G65Y，圖3(b))使肌紅蛋白可以催化O2還原的反應，成功將肌紅蛋白這一儲存O2的蛋白轉化為人工氧化酶[22]。

然而，CcO中的酪氨酸-組氨酸之間的共價交聯是在天然蛋白中自發產生的，無法在肌紅蛋白中通過常規的點突變得到。為了在肌紅蛋白中模擬這一結構特征，Liu等[20]通過基因密碼子擴展的技術，將1個模擬酪氨酸-組氨酸共價交聯的非天然氨基酸imiTyr引入肌紅蛋白中(圖3(b))。所得到的imiTyr-CuBMb人工酶不僅展示了O2還原的活性，而且反應只產生了4%的副產物H2O2，其反應速率和選擇性與F33Y-CuBMb相比都有了很大的提高。通過對CcO活性中心結構特征的模擬，研究者在肌紅蛋白中實現了氧化酶的活性。人工氧化酶的成功設計也驗證了3個組氨酸配位的CuB中心，酪氨酸、酪氨酸和組氨酸共價交聯對于氧化酶酶活的作用。

氧化酶模型蛋白也為研究氧化酶的反應機制等提供了一個有力工具。活性中心的酪氨酸作為天然氧化酶中的保守氨基酸，一直被認為在反應中提供了質子和電子，可能形成1個自由基中間體。通過在人工氧化酶F33Y-CuBMb的第33位引入一系列有不同氧化還原電勢、pKa的非天然氨基酸，Yu等[23-24]在不對整體結構造成擾動的前提下，精細調整第33位酪氨酸的氧化還原電勢、pKa等性質，測試發現突變體的氧化酶活性與酪氨酸的pKa和氧化還原電勢呈負相關，說明酪氨酸對于酶活有重要影響，也間接支持了酪氨酸參與反應的假說。Yu等[23,25]通過冷凍終止反應捕捉了F33Y-CuBMb與O2和H2O2反應的中間體，在電子順磁共振波譜中發現了酪氨酸自由基的存在，并通過將酪氨酸33Y替換為具有不同電子順磁共振信號的非天然氨基酸，證明了這一自由基位于活性中心的第33位酪氨酸上。這些研究直接證明了活性中心的酪氨酸參與了氧化酶的催化反應，為揭示氧化酶的反應機制提供了新的證據。

基于肌紅蛋白的氧化酶模型，蛋白的酶活僅為天然蛋白的1/400或者更低，這種差異很難通過反應活性中心的改造彌補。CcO活性中心之外的結構揭示了天然蛋白有1個高效的電子傳遞通路，將電子從底物傳遞到活性中心。類似的，Yu等[26]通過引入還原蛋白，為肌紅蛋白高效提供電子，可以提高模型蛋白的電子傳遞效率，從而將人工氧化酶的酶活提高400倍(50 s-1)，達到了天然酶的活性水平。Mukherjee等[27]進一步將肌紅蛋白突變體偶聯到電極表面，實現電子的高效傳遞，將氧化酶的酶活大大提高到5 000 s-1，其電化學表現超過了小分子化合物[27]。這些研究也揭示了雖然通過模擬活性中心可以得到人工金屬酶，但是提高人工金屬酶的酶活還需要考慮電子傳遞等其他因素。

2 其他血紅素酶的改造方法及應用

金屬蛋白的設計改造可以通過定向進化、計算機設計、非天然氨基酸引入等多種策略實現。其中，Arnold課題組的Brandenberg等[28]通過定向進化，將P450單加氧酶、細胞色素c等血紅素蛋白改造為催化卡賓、氮賓轉移的人工酶，實現了環丙烷合成、C—Si、C—C鍵形成等多個自然界不存在的反應。Sun等[29]發展了組合活性中心飽和突變策略(combinatorial active-site saturation test,CAST)用于定向進化，成功改變了多種工業酶的立體選擇性。Liu等[30]通過在熒光蛋白中引入非天然氨基酸，并在蛋白上定點標記Ni配合物，實現了光催化的CO2還原。Das等[31]開發了Rosetta套件作為蛋白質理性設計的有力工具。

血紅素酶作為一大類重要的金屬酶，在激活O2中經歷了一系列共同的中間體，而不同的血紅素酶功能的區別往往在于在血紅素-氧中間體結構中氫鍵、疏水相互作用、質子/電子供體的可及性等對于Fe—O配位環境的精細調控不同。與前述的金屬蛋白中通過定向進化或者計算設計的思路不同，血紅素酶的設計往往依賴通過對于天然酶的結構研究，提取天然血紅素酶活性中心的保守結構特征，通過結構特征模擬的策略，在簡單的骨架蛋白中模擬多種激活氧的金屬蛋白的功能。通過類似的理性設計策略，肌紅蛋白還可以模擬一氧化氮還原酶(NOR)[32-33]、羥胺還原酶[34]、亞硝酸鹽還原酶等氮氧化物轉化相關酶的功能。

血紅素酶的設計也可以結合其他方法。例如，Mirts等[35]最近在Rosetta的輔助下在細胞色素c過氧化物酶的血紅素結合口袋中設計了鐵硫簇的結合位點，模擬了天然的亞硫酸鹽還原酶，并通過進一步改造將模擬酶的活性提高到了天然酶的同一量級。Liu等[20]在肌紅蛋白中引入非天然氨基酸模擬天然的酪氨酸-組氨酸共價交聯，實現了氧化酶的功能。

在實現對天然酶活性、功能的模擬后，模擬酶反過來可以為天然酶的研究提供新的切入點。由于可以在同一個骨架蛋白中模擬不同的酶，研究者在同一個蛋白中比較不同的酶活性和反應機制。通過比較基于肌紅蛋白的CcO和NOR的模型蛋白，Bhagi-Damodaran等[36-37]發現活性中心的第2個金屬離子對于O—O鍵斷裂或N—N鍵形成的不同傾向性，而金屬離子對血紅素中心氧化還原電勢的調控在其中起了重要作用，從而闡述了2個非常相似的金屬蛋白不同反應性的原理。Wu等[38]通過結構研究發現肌紅蛋白中的氫鍵網絡對于其亞硝酸鹽還原酶活性非常重要，而同樣的氫鍵網絡也可能促進過氧化物酶的活性。

3 總結與展望

綜上所述，通過理性設計、引入非天然氨基酸等方法，將天然金屬蛋白的結構特征引入肌紅蛋白等小分子量、易研究的骨架蛋白中，實現對天然蛋白結構、功能的模擬，可以得到模型蛋白。基于模型蛋白可以進一步對天然蛋白的反應機制等進行研究，得到新的知識，最終形成了設計-構建-測試-學習的閉環。對于氧激活蛋白的模擬和理性設計，不僅推動了對于O2激活反應的機制研究，也產生了一些活性較高，甚至超過天然金屬酶活性的人工酶。這些人工酶有望應用于天然產物的選擇性氧化、燃料電池的酶電極構建以及催化新反應，實現新分子的合成。